169668. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3,3'-metilén-bisz (4-hidroxi-5-aza-kumarin) előállítására
169668 5 6 C°-ra, egy liter vízzel extraháljuk és keverjük a polifoszforsav feloldása céljából. Keverés közben lassan hozzáadunk 150 g nátrium-hidrogén-karbonátot és így az oldat pH-ját körülbelül 3-ra állítjuk be. Ezután lehűtjük az oldatot 30 perc alatt, víz segítségé- 5' vei. A 4-hidroxi-5-aza-kumarin csapadékként kiválik. A csapadékot leszűrjük és vízből vagy benzolból átkristályosítjuk. Op.: 242,5 °C (bomlás közben) Kitermelés: 80%. A cím szerinti terméket dioxán és petroléter 10 elegyéből (forráspont: 100-140 °C) vagy abszolút etanolból is átkristályosíthatjuk. Elemanalízis a C8 H s N0 3 összegképletre: számított: C: 58,90%; H: 3,09%; N: 8,56%; mólsúly: 163,132 15 talált: C: 58,81%; H: 3,3 %; N: 7,70%; mólsúly: 161,9. Ugyanehhez a vegyülethez jutunk, ha 31,6 g 3-karbetoxi-4-hidroxi-5-aza-kumarint 210 g polifoszforsawal reagáltatunk a 6. példában megadottak 20 szerint, majd extrahálás és átkristályosítás után a cím szerinti termékhez jutunk. Op: 242,5 °C (bomlás közben). Kitermelés: mintegy 80%. Ugyancsak a cím szerinti vegyületet kapjuk, ha 31,6 g 2. példa szerinti anhidro-származékot kezelünk 25 a 6. példában leírtak szerint. Op: 242,5 °C (bomlás közben) Kitermelés: mintegy 75%. 4 g 3-hidroxi-pikolinoil-malonsav-etilfélésztert 20 ml kénsawal 60 C°-on addig melegítünk, míg feloldódik, azután az oldatot éjszakán át állni hagyjuk. A 30 reakcióelegyet ezután 200 ml jégre öntjük és nátriumhidroxid-oldat segítségével beállítjuk a pH-értéket 3-ra. A keletkező csapadékot leszűrjük és vízből átkristályosítjuk. A terméket szilikagél-lap-kromatográfiával (eluálószer: 70 ml kloroformból, 70 ml 35 benzolból, 30 ml metanolból és 2,5 ml koncentrált ammónium-hidroxid-oldatból álló elegy). A cím szerinti terméket kapjuk. Op: 242,5 °C. Kitermelés: mintegy 60%. A fentiekben egyéb úton, vagy más dehidratálószer- 40 rel előállított végterméknek azonosak az elemanalízis-adatai a fent már megadottakkal. 7. példa 3,3'-Metilén-bisz(4-hidroxi-5-aza-kumarin) (I képletű 45 vegyület) 7 g (0,043 mól) 4-hidroxi-5-aza-kumarint feloldunk 800 ml forró vízben. Az oldathoz 9 ml 36%-os formaiint adunk, és a reakcióelegyet éjszakán át állni hagyjuk. A csapadékot leszűrjük, vízzel mossuk és 60 50 C°-on szárítjuk. 6,4 g-nyi cím szerinti terméket kapunk, amelynek bomláspontja több, mint 300 °C. Kitermelés: 90%. Ez a termék vízben, alkoholban, éterben, kloroformban és benzolban gyakorlatilag oldhatatlan. Old- 55 ható viszont erős savakban és bázisokban. Elemanalízis a C17 Hi0 N 2 0 6 összegképletre: számított: C: 60,36%; H: 2,98%; N: 8,28%; mólsúly: 169,14 talált: C: 60,10%; H: 3,14%; N: 8,41%; ' 60 mólsúly: 166,9. IR-spektrum: abszorpció: 3200 cm_1 -nél (-OH), 1720cm_1 -nél ." . (>CO), 1642 cm_1 -nél és 1582 cm _1 -nél (>C = C< >C = N-) 65 NMR-spektrum trifluor-ecetsavban: 8 H« = 8,67 ppm; 6H7 = 8,05 ppm; 5H 8 = 8,37 ppm; 8 CH2 = 3,81 ppm. Az alábbiakban megadjuk a 3,3'-metilén-bisz(4-hidroxi-5-aza-kumarin) in vitro és in vivo kísérleteit, amelyek bemutatják a találmány szerinti vegyület amőbicid hatását. In vitro kísérletek: Ezeket a kísérleteket folyékony egyfázisú ún. Jones médiumon végezzük, amelyet az Entamoeba histolytica emberre patogén törzzsel oltunk be. Az első kísérletsorozatban a csövecskékbe 6,25—tői 100 jug/ml koncentrációig egyre emelkedő mennyiségben adagoljuk az I. képletű vegyületet. A második kísérletsorozatban a csövecskékbe megfelelő mennyiségű kontrollanyagot, azaz phanquinone-t (4,7-fenantrolin-5,6-kinont) adagolunk. A sorozatokban az első ellenőrző csövecskék csak a tápközegeket tartalmazzák, míg a második ellenőrző csövecskék a tápközegen kívül oldószert is tartalmaznak a hatóanyag feloldására. Az in vitro kísérleteket kétszer végeztük el, és az eredményeket az I, táblázatban összegeztük, ahol is a + jelek az amőba jelenlétére, a — jelek pedig az amőba hiányára mutatnak. I. táblázat Csak tápanyagot tartalmazó ellenőrző csövecskék: 1. mérés + 2. mérés + Tápanyagot és oldószereket tartalmazó ellenőrző csövecskék: 1. mérés + 2. mérés + I képletű, találmány szerinti vegyületet tartalmazó csövecskék: Koncentráció jug/ml 100 50 25 12,5 6,25 1. mérés — — — — + 2. mérés — - — — + Kontrollanyagot (phanquinone) tartalmazó csövecskék: Koncentráció jug/ml 100 50 25 12,5 6,25 1. mérés — - — + + 2. mérés — - — + + Ezek a kísérletek világosan mutatják, hogy a találmány szerinti I. képletű vegyület körülbelül kétszer olyan hatásos, mint a kontrollanyag. In vivo kísérletek: Körülbelül 30 g átlagsúlyú, 3 hetes patkányokat megfertőzünk oly módon, hogy a vakbélbe oltunk 0,3 ml virulens Entamoeba histolytica tenyészetet. Az 3
