169488. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2-nitro- indán- 1,3-dion- származékok előállítására

7 169488 8 Biológiai kísérletek és azok eredményei A találmány szerinti eljárással előállított 2-nitroindán-1,3-dionokat biológiai kísérletekben vizsgáltuk. A kísérletekben a passzív kután anafílaxis módszert (PCA) alkalmaztuk [A. Ovary és 0. E. Bier: Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 81, 584 (1952), J. Goose és A. M. J. N. Blair: Immunology 16, 769 (1969)]. Patkányokban Mota módszerével [I. Mota: Immunology 7, 681 (1964)] hőre bomló homocitotróp antitestet tartalmazó szérumot termeltünk. 250-300 g testsúlyú hím Wistar-patkányokat intraperitoneálisan 0,5 ml Bordetella pertussis vakcinával (4xl010 elölt mikroorganzimus/ml) oltottunk be, és az állatoknak szubkután jinjekcióban 0,5 ml emulziót adtunk be, amelynek összetétele a következő: 100 mg ovalbumin, 2 ml fiziológiás sóoldat és 3 ml nem-teljes Freund-adjúváns. A patkányokat a 18. napon szív-punktúrával Skivéreztettük, az állatok vérét összegyűjtöttük. A szérumot csak a felhasználás előtt olvasztottuk fel. 10 15 20 A szérumot 0,9%-os nátriumklorid-oldattal kétszeresére hígítottuk, és ilyen módon hat sorozat- 25 hígítást végeztünk. Az egyes hígított minták 0,1 ml-ét 250-300 g testsúlyú Wisíar-patkányok borotvált hátbőrébe injíciáltuk, a bőr különböző részeibe. 72 óra elteltével az állatoknak intravénás injekció formájában 0,3 ml 1%-os ovalbumin-oldat 30 és 0,1 ml 5%-os pontamine égszínkék színezék-oldat elegyét adtuk be. (Mindkét oldatot izotóniás sóoldattal készítettük, és az oldatokat Sorensen-pufferrel pH = 7,2 értékre pufferoltuk.) 20 perc elteltével az állatokat leöltük, és megmértük az antitest- 35 -injekció helyén kialakuló kék foltok átmérőjét. A szérum hígítását úgy állítottuk be, hogy az immunreakció a legnagyobb hígítású szérum beadásának helyén negatív legyen, és maximális reakció a legkisebb hígítású szérum beadásának helyén lépjen 40 fel. Általában hat kétszeres sorozathigítást alkalmaztunk, és az állatoknak az 1/4-1/128 hígítású szérummintákat adtuk be. A hatóanyagok aktivitásának meghatározása során azt vizsgáltuk, hogy a vegyületek milyen mértékben csökkentik a maximálisnál kisebb átmérőjű foltok átmérőjét a kontrollokhoz viszonyítva. A vizsgálatokhoz 6-6 állatból álló állatcsoportokat használtunk fel, és a hatóanyagot az ovalbumin intravénás beadása előtt meghatározott idővel adtuk be az álatoknak. Meghatároztuk a vizsgált állatokon kialakuló kék foltok átmérőit, és az eredményeket összehasonlítottuk a kontrollcsoportba tartozó állatokon észleltekkel. A kontroli-csoportba tartozó 6 állatot azonosan kezeltük, azzal a különbséggel, hogy az állatoknak nem adtunk hatóanyagot. A PCA %-os gátlását az alábbi egyenlettel számítottuk ki: PCA %-os gátlása = 100 (1 ), ahol b a = a kísérleti állatcsoportban mért átlagos foltátmérő azokon a helyeken, ahol a kontrollállatok reakciója kisebb a maximálisnál, és b = a kontroli-állatcsoportban mért átlagos foltátmérő azokon a helyeken, ahol az állatok reakciója kisebb a maximálisnál. A hatóanyagot előnyösen 7,2 pH-értékű puffer-oldattal készített és nátrium-hidrogénkarbonáttal semlegesített oldat formájában adtuk be. Az oldhatatlan nátriumsót képező vegyületek esetében a következőképpen jártunk el: a szabad savat 2,5 n nátriumhidroxid-oldattal reagáltattuk, a kivált nát-, riumsót leszűrtük, vízzel lúgmentesre mostuk, majd szárítottuk, és a száraz sót 1%-os metilcellulózos szuszpenzió formájában adtuk be. A fenti kísérletek eredményeit az 1. táblázatban ismertetjük. 1. táblázat Vizsgált vegyület Adagolás módja Dózis mg/kg Adagolás és immunreakció között eltelt idő, perc PCA-reakció %-os gátlása 5-bróm-2-nitro-indán-1,3-dion Na-só oldata 25 25 100 100 0 60 0 60 46 87 30 64 S-metil-2-nitro-indán-1,3-dion Na-só oldata 25 25 100 100 0 30 0 30 66 44 100 47 4-metil-2-nitro-indán-1,3-dion Na-só 1 %-os metilcellulózos szuszpenziója 25 25 100 100 0 60 0 60 2 33 6 57 4-metoxi-2-nitro-indán-1,3-dion Na-só 1 %-os metilcellulózos szuszpenziója 25 25 100 100 0 60 0 60 -2 25 18 36 4