169436. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és analitikai reagens haptének kimutatására és meghatározására
169436 8 C) ösztradiol-17-szukcinil-BSA és lla-ösztradiol-11-szukcinil-BSA elleni antitestek előállítása Idő (nap) 0 Mennyiség (mg) 0,25 Beadás módja i.m. Freund-féle adj úváns + 14 0,25 i.m. + i.m. = intramuszkuláris injekció i.v. = intravénás injekció D) ösztrogének meghatározása Előzetes kísérletben meghatároztuk, hogy az egyes, előzetesen meghatározott megfelelő koncentrációjú ösztradiol-HRP konjugátok enzimaktivitásának milyen részét kötik le a különböző hígítású antiszérumok. 0,5 ml puffert, 0,1 ml ösztradiol-HRP-t és 0,1 ml antiszérumot (1 :100 és 1 : 10 000 közötti hígításokban) szobahőmérsékleten inkubáltunk 30 percen át. Ezután 0,3 ml anti-nyúl DASP (juh antinyúl-gamma-globulin kovalens kötéssel cellulózra kötve) szuszpenziót adtunk hozzá, és a keveréket két órán át ráztuk. Ekkor a keveréket lecentrifugáltuk, és a 0,5 ml térfogatú felülúszó részt összekevertük l,5,ml enzimszubsztrátummal (80 mg 5-amino-szalicilsav és 10 mikroliter 30%-os hidrogénperoxid-oldat 150 ml 15 20 25 A B) bekezdésben előállított termékekkel nyulakat immunizáltunk az alábbi séma szerint: 28 0,25 i.m. 42 0,25 I.V. 49 vérvétel 6,0 pH-jú 0,02 n foszfátpufferben). Egy óra múlva megmértük az extinkciót 450nm-nél. Az alábbi ösztrogén meghatározásokhoz olyan antiszérum-hígítást választottunk, hogy mindig az ösztradiol-HRP enzimaktivitásának mintegy 40%-a legyen lekötve az anti-nyúl DASP-hez szabad ösztrogén távollétében. Rögzített hígítású antiszérum 0,1 ml-ével 0,5 ml ösztron-, ösztradiol- vagy ösztriol-oldatot (koncentrációk 0,1 - 1 000ng/ml) inkubáltunk, azután 0,1 ml ösztradiol HRP-t adtunk az oldathoz a választott koncentrációban, azután az oldatot további 30 percig inkúbáltuk. Azután 0,3 ml juh-anti-nyúl DASP szuszpenziót adtunk hozzá, és a meghatározást a továbbiakban a 30 fenti módon végeztük. A meghatározási módszerek v érzékenységét az alábbi táblázatban szemléltetjük: Az ösztradiol HRP 50%-ának az antitesthez való kötődését megakadályozó ösztrogén-mennyiség ng/ml Antiszérumot indukáló anyag E2 -11-BSA E,-17-BSA konjugát E2 -11-HRP (technika állása) E2 -17-HRP (találmány szerinti) E2 -11-HRP (találmány szerinti) E2 -17-HRP (technika állása) ösztron 1000 ösztradiol 800 1.5 ösztriol 1000 230 14 380 E2 = ösztradiol Hasonló eredményeket kaptunk különféle antiszérumokkal. Pufferként 0,1% laktalbumint tartalmazó 0,1 mólos, 6,0 pH-jú foszfátoldatot használtunk, hacsak mást nem említünk. 2. példa ösztrogén meghatározása A) ösztradiol-17-szukcinil-HRP, ösztradiol-17--maleinil-HRP, ösztradiol-17-glutaril-HRP és ösztron-17-M-karboximetiloxim-HRP előállítása A terméket az l.A) példa szerinti módon készítettük él, az ösztrogén-származékokat mindig mól-50 55 súlyuknak megfelelő mennyiségben alkalmazva. Az ösztron-17-0-(karboximetil)-oximos reakciót dioxán-víz helyett dimetilformamid-víz oldószer-rendszerben végeztük. 60 65 B) ösztrogén meghatározása A meghatározást az l.D) példa szerinti módon végeztük, oly módon, hogy az l.B) és l.C) példa szerint előállított ösztradiol- 17-szukcinil-BSA-val szembeni két antiszérumot használtuk (lásd l.B) és l.C) példát). A meghatározás érzékenységét az alábbi táblázatban szemléltetjük: 4
