169405. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-(helyettesített)amino-3- (helyettesített)-piridazinil-tiometil -cef-3-em-4-karbonsav-származékok előállítására

11 169405 12 A csapadék nyers 7-(0-formil-2-fenil-2-hidroxi-acetamido)-3-[6'-(3'-metoxi-piridazinil)-tiometil]-cef-3-em-4-karbonsav-l'-oxid. A csapadékot feloldjuk 100 ml 10%-os vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldatban, majd a kapott oldatot szobahőmérsékleten 3 órán át keverjük. A folyadékot ezután polisztirol-gyantával töltött oszlopra felvisszük, majd az oszlopot vízzel eluáljuk. Az eluátumot liofilizálva 1,5 g 7-[D-(-)-2-fenil-2-hidroxi-acetamido]-3-[6'-(3'-metoxi-piridazinil)-tiometil]-cef-3-em-4-karbonsav-l '-oxid -nátriumsót kapunk. Ez a termék megegyezik a 2. példában előállított termékkel. Minimális gátlási koncentrációk: (mikrogramm/ /milliliter) Staphylococcus aureus 209P Staphylococcus aureus 1840 Escherichia coli NIHJ Klebsiella pneumoniae 7. példa 0,78 1,56 1,56 1,56 40 ml vízmentes tetrahidrofuránban feloldunk 2,36 g O-tetrahidropiranil-mandulasavat és 1,01 g trietil-amint, majd a kapott oldathoz -IOC -on l,36g klór-hangyasav-izobutilésztert adunk. A kapott elegyet ezután ezen a hőmérsékleten 20 percen át keverjük. Eközben külön elkészítjük 1,01 g trietil-amin és 3,74 g 7-amino-3-[6'-(3'-klór-piridazinil)-tiometil]-cef-3-em-4-karbonsav-l'-oxid vizes oldatát 35 ml vízzel. Az így kapott oldatot összekeverjük az előzőekben kapott oldattal, majd a reakcióelegyet 5 C -on 1 órán át és szobahőmérsékleten 1 órán át keverjük. Ezt követően a reakcióelegyből a tetrahidrofuránt csökkentett nyomáson ledesztilláljuk, majd a maradékhoz 20 ml víz és 100 ml etil-acetát elegyét adjuk. A reakcióelegy pH-ját ezután 10%-os vizes sósavoldattal 3,0-ra beállítjuk, majd a reakcióelegyet összerázzuk és két fázisra szétválasztjuk. Az etil-acetátos fázist vízzel mossuk, szárítjuk és csökkentett nyomáson bepároljuk. A maradékhoz 20 ml trifluor-ecetsavat adunk, majd a keveréket 30 percen át keverjük. Ezután a keverékhez 100 ml vízmentes étert adunk," és a kivált csapadékot kiszűrjük. A terméket ezután feloldjuk 20 ml 5%-os vizes nátriurn-hidrogén-karbonát-oldatban, majd a kapott oldatot polisztirol-gyantával töltött oszlopra felvisszük. Az oszlopot 5%-os vizes etanol-oldattal eluáljuk, majd az eluátumot liofilizáljuk. így 1,2 g 7-[D-(-)-2-fenil-2-hidroxi-acetamido]-3-[6'-(3'-klór-piridazinil)-tiometil]-cef-3-em-4-karbonsav-1 '-oxid-nátriumsót kapunk. A termék azonos a 4. példában ismertetett módon előállított termékkel. Minimális gátlási koncentrációk: (mikrogramrrV /milliliter) Staphylococcus aureus 209P Staphylococcus aureus 1840 Escherichia coli NIHJ Klebsiella pneumoniae Proteus vulgaris Proteus morganii Eb53 0,78 1,56 1,56 0,78 3,125 25 8. példa 45 ml víz és 25 ml aceton elegyében feloldunk 1,77 g 7-amino-3-[6'-(3'-metil-piridazinil)-tiometil]-5 -cef-3-em-4-karbonsav-2'-oxidot és 1,35 g nátrium-hidrogén-karbonátot, majd a kapott oldathoz jeges hűtés és keverés közben D-(—)-mandulasavból és foszgénből előállított gyűrűs karboxi-anhidridből 1 g-ot adunk kis adagokban. A beadagolás befejez-10 tével a jeges fürdőt eltávolítjuk, majd a reakcióelegyet 3 órán át keverjük. A reakcióelegyet ezután kétszer éterrel mossuk, majd pH-ját híg sósavoldattal 3-ra beállítjuk. Az ekkor kivájt csapadékot kiszűrjük, majd 15 ml 5%-os vizes nátrium-hidro-15 gén-karbonát-oldatban feloldjuk. A kapott oldatot polisztirol-gyantával töltött oszlopra felvisszük, majd az oszlopot vízzel eluáljuk. A kapott eluátumot liofilizálva 835 mg 7-[D-(-)-2-fenil-2-hidroxi-acetamido]-3-[6'-(3'-metil-piridazinil)-tiometil]-cef-3-20 -em-4-karbonsav-2'-oxid-nátriumsót kapunk. A termék azonos az 1. példában ismertetett módon előállított termékkel. 25 9. példa O 24 órán át 28 C -on végzett inkubálás után négy ferde-agar-tenyészetből (A táptalaj, 2% agar-agar) az Escherichia coli (IFO-13502) sejtjeit elkülönítjük, 30 majd szuszpendáljuk 40 ml fiziológiás konyhasóoldatban. E szuszpenzió 10 ml-es aliquotjaival 2 literes, Sakaguchi-féle palackokba töltött 500-500 ml B táptalajt beoltunk. A palackokat ezután rázatás közben 24 C -on 24 órán át inkubáljuk oltóanyag 35 készítésére. Az oltóanyaggal azután 200 literes fermentáló tartályba töltött 100 liter B táptalajt (amely még 0,0059? Antifroth F 102 jelzésű anyagot tartalmaz) beoltunk, majd 24 C -on 50%-os levegőztetés és 150 fordulat/perc sebességű keverés 40 mellett 24 órán át tenyésztünk. A tenyésztés után a nedves sejteket Sharpless-típusú centrifugával elkülönítjük és 5 liter tiszta vízben szuszpendáljuk. Miután a sejteket alaposan átmostuk, a szuszpenziót másodszor is centrifugáljuk, amikor is 45 mintegy 1100 g mosott nedves sejtet kapunk. A mosott sejteket ezután 10 ml 0,5 mólos citrát-foszfát-pufferrel szuszpendáljuk olyan koncentrációban, hogy a szuszpenzióban a sejtkoncentráció a fermentlé sejtkoncentrációjának tízszerese legyen. A 50 szuszpenzióhoz ezután lóOmillimól 2-fenil-2-hidroxi-acetil-glicin és 80 mülimól 7-amino-3-[6'-(3'-metil-piridazinil)-tiometil]-4-metoxi-metoxi-karbonil-cef-3-em-2'-oxid 10 ml 0,5 mólos citrát-foszfát-pufferrel készült oldatát adjuk. A reakcióelegyet ezután 55 keverés közben 37 C°-on tartjuk 4 órán át, amikor is 4 óra elteltével a reakcióelegyben 22 millimól 7-(2--fenil-2-hidroxi-acetamido)-3-[6'-(3'-metil-piridazinil)-tiometil]-4-metoxi-metoxi-karbonil-cef-3-em-2'-oxid akkumulálódik (kvantitatív polarimetriával megha-60 tározva). A terméket elkülönítjük és 50 ml trifluor-ecetsavat adunk hozzá jeges hűtés közben. A kapott keveréket 1 órán át keverjük, majd vízmentes étert adunk hozzá. Az ekkor kiváló csapadékot kiszűr-65 jük, majd 5%-os vizes nátrium-hidrogén-kar-6