169402. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cefem-karbonsav-származékok előállítására

13 169402 14 3. referenciapélda Escherichia coli (IFO-13502) mikroorganizmusnak a 2. referenciapéldában ismertetett módon kezelt tenyészetéből elkülönített, majd mosott sejtjeit olyan mennyiségben vett desztillált vízzel szuszpendáljuk, hogy a kapott szuszpenzióban a sejtek koncentrációja tízszerese legyen az eredeti fermentlé koncentrációjának, és miközben a szuszpenzió pH-értékét automatikus pH-szabályzó berendezéssel 6,0 körül tartjuk, az alábbi reakciók mértékét mérjük 37 C -on. 1. A cefalotin képződésének aránya 80 millimól TA-ból és 20 millimól 7-ACA-ból kiindulva, 2. A cefalotin képződési aránya 80 millimól TAG-ból és 20 millimól 7-ACA-ból kiindulva, 3. 20 millimól cefalotin (TA és 7-ACA képződési aránya) hidrolízisének aránya, 4. 80 millimól TAG hidrolízisének aránya (TA és glicin képződési aránya). Az 1., 2. és 3. pontok alatt említett reakciókban képződött termékek arányát spektrofotometriásán mérjük, míg a 4. pont alatt említett reakció esetében a képződött termékek arányát úgy állapítjuk meg, hogy a hidrolízis során felszabaduló glicint ninhidrinnel megtitráljuk [lásd: Analyst, 80, 209, (1955)]. A kapott eredményeket az alábbi III. táblázatban adjuk meg, ahonnan látható, hogy a TAG-ból és 7-ACA-ból kiindulva a cefalotin képződési aránya mintegy hétszer nagyobb a cefa-5 lotin TA-ból és 7-ACA-ból kiinduló szintézisének képződési arányánál és megközelíti a cefalotin hidrolízisének az arányát. Látható továbbá, hogy a fentiekben említett baktérium alkalmazása esetében a cefalotin* hidrolízisének az aránya jóval nagyobb 10 a cefalotin képződésének az arányánál. A táblázatból látható tovább, hogy ha az említett mikroorganizmus jelenlétében 160 millimól TAG-ból és 40 millimól 7—ACA-ból kiindulva történik a cefalotin szintetizálása, akkor a cefalotin képződési 15 aránya azonos lesz a cefalotin hidrolízisének az arányával akkor, amikor éppen mintegy 20 millimól cefalotin képződött, azaz a cefalotin nettó képződési aránya az adott pillanatban nulla lesz. Ha a TAG koncentrációja csökken, akkor a cefalotin 20 akkumulálódásának az aránya a reakcióelegyben negatív lesz. így bár a képződött cefalotin mennyisége jóval meghaladja a 160 millimól TA-ból és 40 millimól 7-ACA-ból maximálisan képződő cefalotin mennyiségét (vagyis az egyensúlyi állapotban 25 akkumulálódott cefalotin mennyiségét), a legjobb esetben is csak mintegy 20 millimól (50%-os konverziófok) a képződött cefalotin mennyisége. III. táblázat Szubsztrátumok Meg- Különböző időpontokban mülimólban mért Reakció (millimólban) határozandó koncentrációértékek sebesség vegyület (a reakció kezdetétől számítva percekben) (//mól/perc) 10 20 30 60 90 120 150 TA (80) + 7-ACA (20) CET (képződött) 0,54 0,83 1,23 1,49 2,01 2,16 2,53 TAG (20)> 7-ACA (20) CET (képződött) 2,32 3,31 3,23 2,42 1,25 1,10 1,01 TAG (80) • 7-ACA (20) CET (képződött) 2,33 4,14 6,42 7,28 5,53 4,31 3,55 CET (18) TAG (80) CET (elbomlott) 15,92 13,50 10,58 8,78 Glicin (képződött) 19,40 25,10 45,82 59,23 74,93 0,05 0,36 0,36 0,36 2,29 1. példa 55 Escherichia coli (IFO-13502) négy ferde tenyészetét (2% agar-agart tartalmazó A jelzésű táptalajon) 24 órán át 48 C°-on tartjuk, majd a tenyészetből a sejteket elkülönítjük, és ezt követően 40 ml fiziológiás konyhasóoldatban szuszpendáljuk. 60 Eközben 2 literes rázólombikokba 500-500 ml B jelzésű táptalajt töltünk, majd a táptalajt beoltjuk a fenti módon készített sejtszuszpenzióból 10-10 ml-rel. A lombikokat ezután rázás közben 24 órán át 24 C°-on tartjuk, és így törzstenyészetet 65 állítunk elő. Ebből a törzstenyészetből ezt követően 2 literrel beoltunk egy 200 liter térfogatú tartályba töltött 100 liter mennyiségű B jelzésű táptalajt (a táptalaj 0,005%-ban habzásgátlót tartalmaz), majd az így beoltott táptalajt levegő bekeverése és keverés közben 24 órán át inkubáljuk 50%-os levegőztetés, 150 fordulat/perc sebességű keverés és 24 C° inkubálási hőmérséklet betartása mellett. A tenyésztés után a nedves sejteket centrifugán elkülönítjük és 5 liter tiszta vízben szuszpendáljuk. Miután a sejteket alaposan átmostuk, a szuszpenziót ismételten centrifugáljuk, és így 7