169402. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cefem-karbonsav-származékok előállítására

169402 3 < 4 általános képletű 7-amino-cefem-4-karbonsav-származék valamilyen acil-halogeniddel - amely egy jellegzetes acilezőszer - végzett acilezésénél a reagáltatást úgy foganatosítják, hogy a 7-amino-cefem-4--karbonsav-származékra vonatkoztatva az acilezőszert legalább ekvimoláris mennyiségben használják. Ha viszont az acil-halogenidet - amely már önmagában is rendkívül reakcióképes — feleslegben alkalmazzák, akkor az instabil 7-amino-cefem-4-karbonsav-származék részben olyan nem kívánatos mellékreakciót szenved, amely csökkenti az eljárás hozamát. További nehézség a reakcióparaméterek megfelelő ellenőrzése a mellékreakciók visszaszorítására. Széles körű kutatásokat folytattunk az I általános képletű félszintetikus cefem-karbonsavészterek előállítása céljából javított eljárás kidolgozására, és felismertük, hogy egy enzimatikus kondenzációs reakció hasznosítható valamely II általános képletű szerves sav valamelyik telített hidrilizálható származékából és valamely III általános képletű 7-amino-cefem-4-karbonsav-származékból az I általános képletű vegyületek előállítására. Azt találtuk tehát -mint ez az 1. referenciapéldából látható -, hogy az Escherichia, Bacillus, Proteus és Pseudomonas nemzetségekbe tartozó baktériumfajok között vannak olyan mikroorganizmusok, amelyek képesek valamely II általános képletű szerves savból vagy valamelyik említett hidrolizálható származékából és valamilyen Illa általános képletű 7-amino-cefem-4-karbonsav-származékból, azaz egy olyan III általános képletű vegyületből, ahol R3 jelentése hidrogénatom, egy la általános képletű cefem-karbonsav-származékot (azaz egy olyan I általános képletű cefem-karbonsavésztert, ahol R3 jelentése hidrogénatom) termelni.- További kutatások vezettek arra a felismerésünkre, hogy a fenti reakciót katalizáló bakteriális eredetű enzimek rendkívül hatásosak az la általános képletű vegyületek hidrolizálásában, amikor is a hidrolízis során a II és Illa általános képletű vegyületek képződnek. Felismertük továbbá, hogy ezek a reakciók jóval gyorsabbak, ha acilezőszerként valamely II általános képletű vegyület helyett annak valamely említett hidrolizálható származékát használjuk. így, ha acilezőszerként valamely II általános képletű szerves savat használunk, akkor ezek a bakteriális eredetű enzimek katalizálják az A reakcióvázlatban bemutatott reverzibilis reakciót, és — mint az a 2. referenciapéldából látható - a K egyensúlyi állandó jóval kisebb, mint az egységnyi egyensúlyi állandó (lásd a későbbiekben a II. táblázatot). E táblázat szerint az la általános képletű vegyületek hidrolízisének aránya jelentős mértékben nagyobb, mint az la általános képletű vegyületek képződési aránya. Az A reakcióvázlatban R, R1 és R jelentése a fenti. Ha valamely II általános képletű sav helyett annak valamelyik említett hidrolizálható származékát, például glicin-származékát alkalmazzuk, akkor az la általános képletű vegyületek képződési aránya lényegesen nő és lényegében egyenlő lesz az la általános képletű vegyületek hidrolízisének az arányával (lásd a későbbiekben a 3. referenciapéldát). Az említett szerves sav-származék azonban könnyen hidrolízist szenved az említett enzimek jelenlétében a fenti kondenzációs reakcióban, és így II általános képletű szerves sav és glicin képződik. Még ha az említett szerves sav-származékot igen nagy koncent-5 rációban alkalmazzuk is annak érdekében, hogy az la általános képletű termék a fentiekben említett egyensúlyi reakció pillanatnyi egyensúlyának megfelelően nagy mennyiségben képződjék, az így „összegyűlt" la általános képletű vegyület abban az 10 esetben, ha a szerves sav-származék és a Illa általános képletű vegyület koncentrációja csökken, hidrolizál. így megállapítható, hogy az egyensúlyi koncentráción túlmenően rendkívül nehéz az la általános képletű termék koncentrációját megnövelni 15 (lásd a 3. referenciapéldát). Meglepő módon azonban azt találtuk, hogy valamely II általános képletű vegyület valamelyik említett hidrolizálható származékából és valamely III általános képletű vegyületből kiindulva egy I álta-20 lános képletű vegyület képződési aránya közel egyenlő valamely la általános képletű vegyület képződési arányával (az utóbbi esetében természetszerűleg valamely II általános képletű vegyület valamilyen származékából és valamely Illa általános 25 képletű vegyületből indulunk ki), és a képződött I általános képletű vegyület nem hidrolizál, függetlenül attól, hogy a reakcióidő milyen hosszú. Következésképpen valamely I általános képletű vegyület valamely II általános képletű vegyület vala-30 melyik említett hidrolizálható származékából, és valamely III általános képletű vegyületből kiindulva nagy hozammal állítható elő. Ismeretes, hogy a mikroorganizmusok termelte enzimek hatása rendkívüli mértékben függ a 35 szubsztrátumtól [Dixon M.: „Enzymes" 2. kiadás, 199-258. o. (1964), megjelent a Longmans londoni kiadó gondozásában], és így az I általános képletű vegyületek enzimreakcióban való előállíthatósága a II általános képletű vegyületek vala-40 melyik említett hidrolizálható származékából és III általános képletű vegyületekből nem lehet az ezen a területen jártas szakember számárakézenfekvő pusztán abból a tényből, hogy az la általános képletű vegyületek előállíthatók a II általános kép-45 létű vegyületekből. Sőt meglepőnek kell tekintenünk, hogy a II általános képletű vegyületek valamelyik említett hidrolizálható származékából és a III általános képletű vegyületekből kiindulva az I általános képletű vegyületek jóval nagyobb arány-50 ban állíthatók elő, mint a II általános képletű vegyületek valamelyik említett hidrolizálható származékából és a Illa általános képletű vegyületekből kiindulva az la általános képletű vegyületek. Továbbá ismeretes, hogy a legtöbb enzim hatása 55 megszűnik a szubsztrátum nagy feleslegétől [Webb, G. L.: „Enzyme and Metabolic Inhibitors", 1. kötet, lll.o. (1963), megjelent az Academic Press new-yorki kiadó gondozásában]. Ezt a hatást „szubsztrátum-inhibitálásnak" is nevezik. A nap-60 jainkban ismert legtöbb penám-karbonsav-származékok és cefem-karbonsav-származékok enzimreakcióban való előállítására szolgáló módszer esetében a szubsztrátum koncentrációja mintegy 0,1 — 1%. A találmány szerinti eljárásban a fentiekben em-65 lített „szubsztrátum-inhibitálás" nem jelentkezik 2