169383. lajstromszámú szabadalom • Eljárás stabil H3N2 influenza-vírustörzs és az azt tartalmazó élő vírus-vakcinák előállítására
5 169383 6 sének felel meg, a 7. lépéstől kezdve a törzs szérum-inhibitorokkal szemben rezisztens. Az így kapott, szérum-inhibitorokkal szemben teljes mértékben rezisztens vírustörzs nem patogén, immunogén, és előnyösen alkalmazható élő inf- 5 luenza vírus-vakcinák előállítására. A vakcinákat az élő influenza vírus-vakcinák előállítására és/vagy stabilizálására alkalmas bármilyen ismert módszerrel előállíthatjuk. Következésképpen a találmány tárgya továbbá eljárás a fenti típusú, szérum-inhibitorok- 10 kai szemben rezisztens vírustörzset tartalmazó, legyengített influenza vírus-vakcinák előállítására. A legyengített influenza vírus-vakcinákat a találmány szerint úgy állítjuk elő, hogy a fenti módon 15 előállított, szérum-inhibitorokkal szemben rezisztens Alice influenza-vírustörzset (ATCC VR 776) embriót tartalmazó tyúktojások allantoisz-üregében nagymennyiségű vírus növekedéséhez szükséges ideig inkubáljuk, a kapott vírusanyagot elkülönít- 2o jük, végül kívánt esetben fagyasztva szárítjuk. Az így kapott legyengített influenza vírus-vakcinákat helyileg adjuk be az orrüregbe. 25 Vakcinás kezelés céljára a vírust előnyösen fagyasztva szárított állapotban tároljuk, és a vakcinát csak közvetlenül a beadás előtt állítjuk elő úgy, hogy a fagyasztva szárított víruskészítményhez vizet vagy bármilyen más ismert nazálisán beadható 30 készítmények, például cseppek vagy permetek előállításához szokásosan alkalmazott gyógyszerészeti hígítóanyagot vagy kompozíciót adunk. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör 35 korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. 1. példa A vírus előállítása Kiindulási vírusként öt véghígításos tenyésztési lépésnek alávetett, normál szérum-inhibitorokra nagymértékben érzékeny MRC-2 vírustörzset (ATCC VR 777) használunk fel. A kiindulási vírus- 50 -anyagból normál nátriumklorid-oldattal különböző koncentrációjú (10~\ 10"3 , 10 -5 és 10~ 7 ) elegyeket készítünk, és ezeket az elegyeket nátriumklorid-oldattal készített, különböző hígítású (1/4, 1/8, 1/16, 1/40, 1/200 és 1/4000) sterü normál 55 tengerimalac-szérummal elegyítjük. A szérumhígításbk előállítása során először az 1/4-es hígítású szérummintát készítjük el, ezt 15 percig forrásban levő vízben tartjuk, majd a kívánt koncentrációra hígítjuk, homogenizáljuk, és 2000 fordulat/perc se- 60 bességen 30 percig centrifugáljuk. A vírus-szérum elegy készítéséhez az így kapott felső folyadékfázist használjuk fel. A vírus-szérum elegyeket 1 órán át 37 C -on inkubáljuk, majd a kapott elegy 0,2 ml-es mintáit előzetesen 9-10 napig 37 C -on 65 keltetett, majd lámpázott, embriót tartalmazó tyúktojások allantoisz-üregébe fecskendezzük. A tenyésztéshez csak az élő embriókat tartalmazó tojásokat "használjuk fel. Ezután a tojásokat 24-96 órán át tovább inkubáljuk. Az inícubálási idő lejartakor a tojásokat lámpázzuk, és az élő embriókat tartalmazó tojásokat 4C°-ra hűtjük. Minden egyes kísérletben elkülönítjük az élő embriókat tartalmazó tojások allantoisz-folyadekát, az elkülönített folyadékokat egyesítjük, és hemagglutinációs módszerrel meghatározzuk az influenza-vírus jelenlétét. A következő tenyésztési lépéshez a legnagyobb vírus-hígítás (azaz legkisebb vírus-koncentráció) és legnagyobb szérum-koncentráció esetén kapott, még hemagglutinációs aktivitást mutató allantoisz-folyadékokból elkülönített mintát használjuk fel (ez esetünkben a 10 "3 víruskoncentrációval és 1/16-os szérum-hígítással kapott minta). A második tenyésztési lépést az előzővel teljesen azonos körülmények között végezzük. A legnagyobb vírus-hígítás (esetünkben 10-7 ) és legnagyobb szérűm-koncentráció (esetünkben 1/4-es hígítás) fenntartásával végzett tenyésztési lépésből származó vírusok hemagglutinációs aktivitással rendelkeznek, és - amint az 1. táblázat adataiból kitűnik - normál szérum-inhibitorokkal szemben teljes mértékben rezisztensek. Ezután a kapott rezisztens mutáns szaporítására és a rezisztens jelleg stabilitásának ellenőrzésére szérum távollétében három további véghígításos tenyésztési lépést végzünk. Amint az 1. táblázat adatai mutatják, az egyes tenyésztési lépések után elkülönített vírusok a normál szérum-inhibitorokkal szemben teljes mértékben rezisztensek maradtak. Az utolsó tenyésztési lépésben kapott vírust használjuk fel az Alice törzs (ATCC VR 776) szaporításának és az oltóanyag előállításának inokulumaként. Az elkülönített allantoisz-folyadékokat e célból összegyűjtjük, megvizsgáljuk sterilitásukat, tengerimalac és egér vakcinázásával ellenőrizzük az anyag hatását, 5%-os peptontartalom eléréséig peptonnal elegyítjük, majd a kapott elegy 0,5 ml-es részleteit 3 ml-es ampullákba töltjük, és fagyasztva szárítjuk. A módosított vírus in vitro és in vivo körülmények között meghatározott jellemzői 1. Inhibitor-rezisztencia A vírusok 1 órán át 75 C -on hőkezelt állati szérumokban (ló-, tengerimalac- és boíjúszérumban) jelenlevő inhibitorokkal szembeni rezisztenciáját a következőképpen vizsgáljuk: A hőkezelt normál szérumból sorozathígítást készítünk (a sorozat egyes tagjait kétszeresre hígítjuk), és a sorozat egyes tagjait 4 hemagglutinációs egységnek megfelelő mennyiségű módosított vírussal, illetve alapvírussal elegyítjük. Az elegyet 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk, majd csirke-vörösvérsejtekkel elegyítjük, és az eredményeket feljegyezzük. Az eredményeket az 1. táblázatban ismertetjük. 3
