169364. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az FR-02A antibiotikum előállítására
169364 19 20 majd az így kapott inokulum-kultúrából l-l ml mennyiséget átviszünk tíz Erlenmeyer-lombikba, amelyek 40-40 ml termelő tápközeget tartalmaztak. Ez a termelő tápközeg szuszpendált szilárd tápanyagtól lényegileg mentes, összetétele pedig az alábbi: Termelő-tápközeg: Difco-féle tápanyag 0,8% Difco-féle élesztőkivonat 0,2% dextróz 1,0% desztillált vízben. Mindegyik lombikhoz az autoklávban történő sterilizálás előtt egy csepp P—2000 habzásgátlószert adtunk. Sterilizálás és lehűlés után a tápközegeket a fentebb említett módon beoltjuk az inokulum-kultúrával, majd mindegyik lombikot 5 napig inkubáljuk, 28 C° hőmérsékleten a fentebb megadott hőmérsékleten. Ezután a fermentációt befejezzük és a termelt antibiotikumot elkülönítjük. Az FR-02A antibiotikum elkülönítése: A fenti módon kapott fermentleveket a tíz lombikból egyesítjük és az összesen 400 ml fermentlé pH-értékét sósavval 5,5-re állítjuk. 500 ml kloroformot adunk hozzá és fél óráig keverjük szobahőmérsékleten. Ezután a fázisok szétválasztása céljából centrifugáljuk az elegyet, a vizes fázist elkülönítjük és elvetjük, a kloroformos fázist pedig vízmentes magnézium-szulfáttal szárítjuk és vákuumban szárazra pároljuk. A kapott bepárlási maradékot 30 ml hexánnal mossuk és levegőn megszárítjuk. Maradékként nyers FR—02A antibiotikumot kapunk. 6. példa Az FR—02A antibiotikum termelés rázólombikos fermentációval, Streptomyces lactamdurans NRRL 3802 kultúrával Inokulumként a Streptomyces lactamdurans mikroorganizmus NRRL 3802 törzsének liofilizált kultúráját alkalmazzuk. A liofilizált kultúrát egy 250 ml-es Erlenmeyer-lombikban levő, alábbi összetételű 40 ml első fokozatbeli inokulum-tápközeghez adjuk: Első fokozatbeli inokulum-tápközeg: primer élesztő 1% desztillált vízben pH nátrium-hidroxiddal beállítva 7,0 Az első fokozatbeli tápközeget, valamint a továbbiak során a második fokozatbeli inokulum-kultúrát, valamint az azt követő termelő szakaszban alkalmazott kultúrákat 28 C hőmérsékleten inkubáljuk, percenként 220 fordulattal működtetett forgó keverőkészülékben. 10 Az első fokozatbeli inokulum-kultúrát 2 napig inkubáljuk a fent megadott körülmények között, majd a kultúrából l-l ml-t átoltunk 40 ml második fokozatbeli inokulum-tápközegbe, ugyancsak 5 250 ml-es Erlenmeyer-lombikba. Ez utóbbi tápközeg Összetétele: Második fokozatbeli inokulum-tápközeg: 10 Ardamine YEP (99F) 1% desztillált vízben pH nátrium-hidroxiddal beállítva 7,0. Ezt a második fokozatbeli inokulum-kultúrát 15 1 napig inkubáljuk a fent megadott körülmények között, majd l-l ml mennyiséget átoltunk 10 Erlenmeyer-lombikba, amelyekbe előzőleg 40 ml alábbi összetételű termelő tápközeget vittünk be: 20 Termelő tápközeg: kukoricalekvár 2,8 súly% dextróz 5,6 súly% Proflo (Difco) 2,8 súly% 25 glicerin , l,4tf.% dimetil-formamid 1,4 tf.% vízvezetéki vízben pH nátrium-hidroxiddal beállítva 7,3 30 Mindegyik lombikhoz, az autoklávban történő sterilizálás előtt 1 csepp P—2000 habzásgátlószert adtunk. 6,25 g Na2S 2 0 3 • 5H 2 0 100 ml desztillált vízben történő oldása útján kapott nátrium-tioszulfát 35 oldatot steril-szűrőn történő szűréssel sterilizálunk, majd az autoklávban sterilizált termelő tápközeget tartalmazó lombikok mindegyikébe 0,5 ml ilyen nátrium-tioszulfát-oldatot adagolunk. Beoltás után a termelő tápközeget tartalmazó 40 lombikokat 5 napig inkubáljuk 28 C hőmérsékleten a fent megadott körülmények között, majd a fermentációt megszakítjuk, a kapott fermentleveket egyesítjük és a termelt antibiotikumot kinyerjük. 45 Az FR-02A antibiotikum elkülönítése: A kapott összesen 400 ml fermentlé pH-értékét sósav hozzáadásával 5,5-re állítjuk, majd a micéliumot és a szuszpendált szilárd tápanyagokat el-50 különítjük a fermentlé leszűrése útján. A kapott szűrlethez 500 ml kloroformot adunk és fél óra hosszat keverjük. Ezután az elegyet a fázisok szétválasztása céljából centrifugáljuk, a vizes fázist kiselejtezzük és a kloroformos fázist vízmentes mag-55 nézium-szulfáttal szárítjuk. Az oldószert vákuumban elpárologtatjuk és a maradékot 30 ml hexánnal mossuk, majd levegőn megszárítjuk. így termékként az FR-02A antibiotikumot kapjuk. 60 Az FR—02A antibiotikum jellemző tulajdonságai: Elemzési adatok: C: 60,98%, H: 7,60%, 65 N: 2,60%.
