169292. lajstromszámú szabadalom • Eljárás neurohormonok elkülönítésére szarvasmarhahipotalanuszból

3 169292 4 tartalmazó frakciókat és az utolsó alacsony molekulasúlyú anyagként az oszlopot elhagyó ,JS" neurohormont tartalmazó frakciókat külön-külön elkülönítjük, és kívánt esetben külön-külön liofilizálva megszárítjuk. A „K" neurohormon aminosavakat, így glicint, szerint, aszparaginsavat és glutaminsavat, valamint egy nukleotid jellegű ultraibolya spektrummal rendelkező vegyületet tartalmaz. A „K" neurohormon ultraibolya tartományban jellegzetes spektrummal rendelkezik, savas kémhatású, 3000 V feszültségen 3,8 pH-értékű citrát-pufferben végzett papírelektroforézis során az anód irányába mozdul el, féligáteresztő membránon dializálható, alkalikus kezelés, valamint 24 órán át 105 C°-on 6 n sósavval végzett hidrolízis hatására biológiai aktivitását elveszíti, továbbá jelentősen veszít biológiai aktivitásából pepszínnel és tripszinnel végzett kezelés során is. A „K" neurohormon cellulózbázisú, 200-400 mesh szemcsemérefű molekulaszűrőkön, így például az Uppsala Fine Chemicals svéd cég által gyártott Sephadex G-10 vagy Sephades G—25 márkanevű gélszűrőn desztillált vízzel vagy 0,25 - 0,5%-os ecetsavval végzett frakcionált eluálás során a gélszűrőt a szarvasmarha-hipotalamuszból elkülöníthető ismert alacsony molekulasúlyú vegyületek, így többek között a nukleotidok, adenozin-trifoszfát, adenozin-monofoszfát, más uridin-származékok, aminosavak, hexoaminok, peptidek, aminosav-analógok és foszfolipidek után hagyja el, míg papírkromatográfiás, 4:1:5 arányú butanol-ecetsav-viz elegyben végzett vizsgálata során Rf értéke 0,35. Az „S" neurohormon hőstabil és vízoldható vegyület, kémhatása savas, féligáteresztő membránon átlép, 3000 volt feszültségein 3,8pH-értékű citrát-pufferben végzett papírelektroforézis során a „K" neurohormonnál lassabban mozog az anód felé, míg 4:1:5 arányú butanol—ecetsav—víz elegyben végzett papírkromatográfiás vizsgálat során mérhető Rf értéke 0,15. Az „S" neurohormon nem veszíti el biológiai aktivitását 24 órán át 105 C°-on 6 n sósavval végzett hidrolízis, valamint pepszinnel és tripszinnel végzett kezelés után sem, jellegzetes spektrummal nem rendelkezik, végül az előző bekezdésben említett típusú molekulaszűrőkön végzett frakcionált eluálás során az ugyancsak az előző bekezdésben ismertetett ismert alacsony molekulasúlyú vegyületek, valamint a „K" neurohormon után, utolsóként hagyja el a molekulaszűrőt. A találmány szerinti eljárás foganatosítása során közelebbről úgy járunk el, hogy szarvasmarha-hipotalamuszt 20-30percen át 0,25-0,5%-os ecetsavval extrahálunk, előnyösen 80-85 C hőmérsékleten. Az így kapott extraktumot ezután a szarvasmarha-hipotalamuszból visszamaradó törött csontdarabok és sejtek eltávolítására centrifugáljuk, előnyösen 8 000 - 10 000 g-nél végezve a centrifugálást. Ezt követően a felülúszó fázisból a nagy molekulasúlyú vegyületeket szerves oldószerrel, előnyösen etanollal vagy kloroformmal kicsapjuk, majd a nagy molekulasúlyú vegyületeket célszerűen centrifugálás útján elkülönítjük. Az ekkor visszamaradó elegyet - amely az alacsony molekulasúlyú vegyületeket tartalmazza- ezután liofilizáljuk, majd desztillált vízben feloldjuk. A kapott oldatot ezután felvisszük egy, cellulóz bázisú 200-400 mesh szemcseméretű molekulaszűrőből, 5 előnyösen a korábban említett Sephadex G-10 vagy Sephadex G-25 márkanevű szűrőből készült oszlopra, és az oszlopot desztillált vízzel vagy 0,25 - 0,5%-os ecetsavval frakcionált eluálásnak vetjük alá. Az eluálás sebessége előnyösen 10 100 ml/óra és 700 ml/óra közötti érték. Előnyösnek tartjuk az ecetsavval végzett eluálást, bár ebben az esetben a kívánt anyagokat tartalmazó eluátumfrakciókat utólag az ecetsav tökéletes eltávolítására be kell párolni és az így kapott maradékot még IS desztillált vízzel utólagosan mosni szükséges. Desztillált vízzel végzett eluálás esetében nincs szüksége ezekre az utólagos műveletekre, viszont az ecetsavval végzett eluáláshoz képest a neurohormonok hozama valamivel alacsonyabb. 20 A neurohormonokat tartalmazó eluátumfrakciók megjelenését az 1. kiviteli példában részletesen ismertetett biológiai módszerrel detektálhatjuk. Miként említettük, az ,,S" neurohormon koszorúértágító hatású, éspedig állatoknak l-2jug/test-25 súly-kg dózisban intravénásán beadva 3—5 percen belül kitágítja a koszorúereket. Egy órán belül a vénákból adott időegységen belül kifolyó vér mennyisége a kiindulási szinthez viszonyítva 200-300%-kal nő. Ez a hatás 3-6 órán át tart. A 30 hipofízis ektómiája után az „S" neurohormont az állatoknak beadva az teljes mértékben megtartja koszorúértágító hatását. Ez arra nézve bizonyíték, hogy a hipofízis nem vesz részt az „S" neurohormon koszorúértágító hatásának létrehozásában. A 35 mellékvese ektómiája után viszont az „S" neurohormon hatása eltűnik. Ez arra nézve bizonyíték, hogy az intakt szervezet körülményei között a mellékvese az „S" neurohormon hatásának realizálódásában fontos szerepet játszik. Adott fiziológiai 40 és patológiai körülmények között a hipotalamuszból a neurohormon a vérbe a szív és a hasnyálmirigy kémiai faktorjainak hatására válik ki. Ezek a kémiai anyagok a vérbe kerülve ingerlik a sinus carotiens kemoreceptorjait, miáltal a cholinoreaktív 45 agyi rendszeren keresztül megindul a neurohormon kiválasztása a vérbe, ahol a neurohormon a vérszérum albumínjaival és gammaglobulinjaival laza kötésbe lép, illetve közvetlen hatást fejt ki a koszorúér véredényeire. Ilyen módon bizonyított a 50 hipotalamusz neurohormonjainak szabályozó szerepe a szív keringési rendszerére. A „K" neurohormont az „S" neurohormon előző bekezdésben említett dózisával azonos dózisban az előző bekezdésben ismertetett módon vizs-55 gálva a „K" neurohormon is gyógyászatilag aktívnak bizonyul, éspedig hatása az intravénás beadás után rögtön jelentkezik és 1-1,5 órán át tart. Klinikai körülmények között azonban nem vizsgáltuk. 60 Az „S" neurohormon klinikai körülmények között is vizsgálva koszorúértágító hatásúnak bizonyult, így elsősorban akut szívizominfarktus (angina pectoris) és krónikus koszorúérelégtelenség kezelésére hasznosítható a későbbiekben még rész-65 létezett módon. 2