169168. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 6-amino-penám-3-karbonsav előállítására vízoldható enzim-komplexek segítségével

169168 8 3-5. példa Ezekhez a példákhoz enzim kötőanyagként GANTREZ AN 169-et használunk. Ez a kopolimer maleinsav-anhidrid/metilvinüéterből áll. Molekulasúlya mintegy 1 125 000. Az enzim és a polimer reakcióját az 1. példában leírtak szerint végezzük. Az eredményeket a táblázatban feltüntetett adatok foglalják össze. A polimer — enzim mólarány Protein tartalom (A meghatározást Folin-Ciocalteu módszere szerint marha szérum albuminnal végeztük.) Enzimaktivitás jumól/perc/g jumól/perc/mg protein Szabad dezaciláz enzim -20 mg/ml 63,4+ 31,7 1. példa 2:1 55,0/mg/g 220 40,2 2. példa 2:1 52,5/mg/g 168 32,2 3. példa 1:1 43,3/mg/g 95,5 220,0 4. példa 2:1 18,6/mg/g 44,5 24,0 5. példa 1 :2 71,4/mg/g 172 24,0 + A dimenzió jumól/perc/ml 6. példa 30 5 g mintegy 400 000 mólsúlyú fikollt (szacharóz-epiklórhidrin kopolimer) (Pharmacia Limited, Sweden) oldunk fel 165 ml vízben, majd a pH-t 2 n nátriumhidroxid-oldattal 10,0 értékre állítjuk. A 35 fikoll oldathoz 400 mg brómcianidot adunk, majd az oldatot mámeses keverésnek vetjük alá. A hőmérsékletet 20 C -on tartjuk. A pH-értékét 2 n nátriumhidroxid-oldat hozzáadásával 11,0 értékre állítjuk. 20 perccel a brómcianid hozzáadása után az oldat 40 pH-ját 2 n sósavval 8,5 értékre állítjuk, majd 170 ml vizes penicülin-dezaciláz-oldatot (560 mg protein tartalommal) adunk hozzá. A penicUlin-dezacüáz egy mg proteinre számítva 7,8 pH értéken, 32 C°-on, percenként 6,9 mól 6-APA-t állít elő. Az oldatot egy 45 éjszakán át 4C°-on keverjük, majd ultraszűréssel betöményítjük. Az ultraszűréshez XM-300 Amicon-membránt használunk. A membrán névleges molekulaszűrő határa 300 000-nél van. Az ultraszűrő sejtjei által 50 visszatartott fikoll-penicillin-dezaciláz komplexet mossuk. A kiszűrt anyagot ezt követően 44ml-re betöményítjük, majd 4 C°-on állni hagyjuk. Az így kapott anyag viszkozitása megegyezik a natív enzim viszkozitásával. A fikoll-penicillin-dezaciláz komplex 55 aktivitását az alábbi módon határozzuk meg. 15 ml 0,2 mól foszfátpuffert és 5 ml 20 súly/térfogat%-os benzil-penicillin-oldatot 37C°-on állni nagyúrik. Az oldatot 0,1 n nátriumhidroxid-oldattal 60 7,8 pH-értékre állítjuk be. A reakciót 2 ml enzim-oldat hozzáadásával indítjuk meg. Az oldat pH-értékét 0,1 mól nátriumhidroxid-oldat további hozzáadásával 7,8-as értéken tartjuk. A reakciót 20 percig folytatjuk, miközben percenként méréseket végzünk. 65 Azt tapasztaltuk, hogy a fikoll-penicillin-enzim komplex aktivitása a natív dezaciláz-enzim aktivitásának 86,2%-ával azonos. A fikoll-penicDlin-enzim-komplex protein tartalmát Lowry, Rosebrough és társai módszerével (1951) határoztuk meg. A vizsgálat eredménye szerint az enzimkötődés 87,1%-os. 7. példa A 6. példa szerint járunk el, azonban a penicillin-dezaciláz megkötését 10,0 pH-n végezzük. A kapott termék végső térfogata 40 ml. A kapcsolás hozama 78,5%. Az enzimaktivitás mértéke 74,8%. 8. példa A 6. példa szerint végzett eljárást megismételjük. Ebben az esetben a fikoll és a penicillin-dezaciláz reakcióját 6,0 pH-értéken végezzük. A végtérfogat 35 ml. A protein-megkötés az ultraszűrés után kapott maradék vizsgálata alapján 68%. Az enzimaktivitás értéke 56,7%. 9. példa A 6. példát megismételjük azzal az eltéréssel, hogy fikoll helyett 250 000 molekulasúlyú dextránt alkalmazunk. A kapott termék végtérfogata 44 ml. A dextrán-penicillin-dezaciláz komplex-oldat viszkózusabbnak mutatkozott, mint a fikoll-penicülin-dezaciláz komplex oldata. A megkötött protein mennyisége 73,2%. A dextrán-penicillin-dezaciláz komplex enzimaktivitásának értéke 75,5%. 4