169161. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükozidhidroláz inhibitorok előállítására az Actinomycetales rendbe tartozó törzsekkel

47 169161 48 Az 1. táblázatban felsorolt törzseket vagy az ismert törzsgyűjteményekben, így például az American Type Culture Collection-ben vagy pedig az 1, táblázatban felsorolt CBS-számok alatt a hollandiai Baarnban a Centraalbureau voor Schimmelcultures-ben deponálták. A 2. és 3. táblázatban megadtuk a leírt törzsek néhány jelemzőjét. A glükozid-hidroláz-inhibitorok kinyerése céljából a fentiekben felsorolt törzseket a leírt tápoldatokban tenyésztjük. Eközben arra kell ügyelni, hogy gyakorlatilag minden egyes törzs az optimális termeléshez más mennyiségi és minőségi összetételű táptalajt igényel. A tenyésztést 1-10 napon át végezzük 15—60C°-on, előnyösen 24-50 C°-on rázott lombikban vagy különböző nagyságú fermentorokban, azután a micéliumot elválasztjuk a táptalajtól és aszerint, hogy az inhibitor a tenyészoldatban vagy a micéliumban van, a hatékony részt feldúsítjuk. A tenyészoldatból az inhibitorokat liofilizálással vagy pedig sókkal vagy vízben oldható szerves oldószerekkel (így például rövidszénláncú alkoholokkal és ketonokkal) végzett kicsapással, vagy pedig a hatóanyagoknak ioncserélőn végzett adszorpciójával nyerjük ki. A micéliumból szerves oldószerekkel végzett extrakcióval, így például alkoholokkal, ketonokkal, éterekkel, észterekkel és szulfoxidokkal végzett extrakcióval nyerjük ki az inhibitorokat. A fermentlevet 3000-20 000 fordulat/perc, előnyösen 6—10 000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk 10-60 percen át, előnyösen 30 percen át vagy pedig szűrjük, előnyösen nyomással vagy szűrési segédanyag segítségével és ily módon elválasztjuk a tenyészoldatot és a micélium maradékot. Az inhibitort a tenyészoldatból különböző módokon izolálhatjuk: a) a tenyészoldatot csökkentett nyomáson (10-50 torr) 20-100 C°, előnyösen 40-80 C° fürdőhó'mérsékleten kiindulási térfogatának körülbelül 1/5—1/50 részére betöményítjük. A betöményített extraktumot szűrjük vagy centrifugáljuk és a tiszta szűrletet (tiszta felső réteget) adott esetben kisózás után liofilizáljuk. b) Az inhibitort vízben oldódó szerves oldószerek, így például alkoholok vagy ketonok, előnyösen metanol, etanol vagy aceton hozzáadásával legfeljebb 60—90%-os tartalomig kicsapjuk a tenyészoldatból [vagy az a) eljárás szerint betöményített tenyészoldatból]. Minthogy alacsony oldószer-koncentráció esetén az inaktív kísérőanyagok lecsapódnak, ez a lecsapó eljárás különösen a nem kívánatos kísérőanyagok frakcionált lecsapással történő elválasztására alkalmas. c) Az inhibitorokat kisózzuk az extraktumokból [vagy az a) eljárás szerint betöményített extraktumokból] például ammóniumszulfáttal, konyhasóval stb. A kivált csapadékot centrifugálással vagy szűréssel összegyűjtjük és/vagy közvetlenül acetonnal és éterrel mossuk és vákuumban szárítjuk vagy pedig vízben való visszaoldás után dializáljuk és liofilizáljuk. d) Az inhibitorokat ioncserélőn adszorbeáljuk. Ez az eljárás olyan inhibitorok elválasztására alkalmas, amelyek kémiai természetük következ-5 tében töltéssel rendelkeznek. Az inhibitor deszorbcióját az ionerősség megváltoztatásával vagy az eluálószer pH-értékének megváltoztatásával valósítjuk meg. Az inhibitor mellett gyakran nem kívánatos 10 kíséró'anyagok is előfordulnak a tenyészoldatban. Ezeket a kísérőanyagokat különböző módokon választhatjuk el. Például olyan inhibitorok esetén, amelyek hővel szemben stabilisak, a kísérő anyagokat hővel denaturáljuk vagy kismolekulájú 15 inhibitorok esetén megfelelő membránokon keresztül dializáljuk azokat, ekkor a membrán visszatartja a nemkívánatos kísérőanyagokat, vagy eljárhatunk úgy is, hogy a kísérőanyagokat frakcionáltan lecsapjuk [v.o. b) eljárás] vagy ioncserélőn adszor-20 beáljuk. Az inhibitorokat a micéliumból úgy nyerjük ki, hogy a micéliumot többször extraháljuk szerves oldószerekkel. Előnyösen úgy járunk el, hogy kétszer extraháljuk 10-20 percen keresztül 25 3-5 térfogatrész acetonnal (a micélium nedves térfogatára számítva) és ezt követően egyszer extraháljuk éterrel 5-10 percen keresztül. Az így extrahált micéliumot vákuumban megszárítjuk és ezt követően 3-10 súlyrész dimetilszulfoxiddal 30 íxtraháljuk keverés közben 2-8 órán keresztül, majd 10 000—20 000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk. Az alkoholos és éteres extraktumokat vákuumban szárazra pároljuk és felvesszük a dimetilszulfoxidos extraktummal. 35 A dimetilszulfoxiddal való felvétel helyett eljárhatunk úgy is, hogy a száraz micéliumport hosszabb időn át, előnyösen 12—24 órán keresztül vízzel vagy híg elektrolitoldattal extraháljuk. Az új anyagok vízben jól oldódnak. Az 40 inhibitorok egy csoportja semleges pH-értéken hővel szemben stabilis, savakkal (pH = 2) és lúgokkal (pH =12) szemben is stabilis és lassan dializáiható. Ezeket az inhibitorokat a tripszin és pepszin nem inaktiválja, s az inhibitorok a megne-45 vezett enzimeket nem gátolják. A tipikus protein-színezékekkel nem színezhetők és "az ultraibolya tartományban 250 nvx-ig nem mutatnak jellegzetes abszorpciót. Karbamiddal és /J-merkaptoetanollal nem inaktiválódnak ezek az inhibitorok. Gélszűrés 50 alapján végzett becslés szerint ezeknek az inhibitoroknak a molekulasúlya 500 feletti, azonban 6 000 alatti. Hidrolitikus bontás során monoszacharidokat, például glükózt kapunk. Ezeknek az eredményeknek az alapján ezek az inhibitorok 55 oligo- vagy poliszacharidok illetve azok származékai. Az ebbe a csoportba tartozó legjobb hatású inhibitorok amüázra gyakorolt gátló aktivitása 8 000 AIE/mg. 60 Az inhibitorok egy másik csoportja hővel szemben labilis és nem vagy csak alig dializálható. Ezek az inhibitorok tripszinnel többé vagy kevésbé gyorsan inaktiválhatók. A karbamid és 0-merkaptoetanol a legtöbb ilyen inhibitort inaktiválja. Ezek 65 az inhibitorok valószínűleg peptidjellegű anyagok. 24