169138. lajstromszámú szabadalom • Eljárás malac-colibacillosis vakcina előállítására vemhes kocák számára
5 169138 6 A felülúszó fázist először derítőszűrőn, majd 0,45 mikron hézagméretű Millipore steril szűrőn szűrjük keresztül. A szűrlethez előzetesen etilénoxiddal sterilezett ammóniumszulfátot adunk az 50%-os telítettség eléréséig, (380 g ammóniumszulfát/liter szűrlet), majd az elegyet 3 órán keresztül szobahőmérsékleten állni hagyjuk. A kapott csapadékot 2 órán keresztül 2 550 ford/perc sebességgel 5 C°-on centrifugáljuk. A kivált üledéket cellofán zacskókba visszük és folyóvízzel szemben addig dializáljuk, amíg az ammóniumszulfát koncentrációja 0,1-0,01% értékre nem csökken. Az ammóniumszulfát töménységét Nessler-féle reagenssel határozzuk meg. Az így készített enterotoxin-preparátumot sterilezés céljából 0,45 mikron hézagméretű Millipore steril szűrőn szűrjük keresztül, majd a szűrletet liofilizáljuk. 2. példa lg 1. példa szerint előállított liofilizált enterotoxin-preparátumot 20 ml steril foszfátpuffer-oldat (pH + 7,4) hozzáadásával hidratálunk. A foszfátpuffért úgy állítjuk elő, hogy az alábbi termékeket 10 liter desztillált vízben oldjuk: nátriumklorid káliumklorid dinátriumhidrogénfoszfát káliumdihidrogénfoszfát kalciumklorid • H7 O magnéziumklorid • 6 H2 O 8g 2g 11,5 g 2g 1,325 g lg 10 15 20 25 30 35 40 45 A kapott vakcinát steril körülmények között 20 ml steril Freund-féle adjuvánssal elegyítjük, majd a szuszpenziót 4 ml-es ampullákba töltjük. Az ampullákat leforrasztjuk vagy szorosan lezárjuk. Ilyen módon ampullánként 100 mg liofilizált készítménynek megfelelő enterotoxinvakcinát állíthatunk elő. A készítményhez felhasznált Freund-féle adjuváns könnyű ásványolajpárlat víz az olajban típusú emulziója, amelyhez mannit-monooleáttal stabilizátort és elölt Mycobacterium tuberculosis baktériumokat adtunk. Az egyes ampullák egy egységadagnyi vakcinát tartalmaznak. A vakcinát intramuszkuláris vagy 50 szubkután úton vemhes emséknek adhatjuk be az elles előtt 3—6 héttel. Adott esetben azt is megtehetjük, hogy az adjuvánssal ellátott vakcinát az egységadag egészszámú többszörösének megfelelő mennyiségben 55 nagyobb ampullákba töltjük és így többszörös adagokat állítunk elő. Az E. coli fermentálását folyékony tápközegben a következőképpen végezzük: 6 ml fentiek szerint előállított E. coli tenyészetet (kb. 6.109 baktériumot) 300 ml PP 3 tápközeget tartalmazó lombikokba oltunk át, majd a tenyészeteket 1 napon keresztül rázóasztalon rázatjuk 22—24 ford/perc sebességgel. 5 lombik tartalmát egyesítjük és 2 órán keresztül 2 550 ford/perc sebességgel centrifugáljuk. Az üledéket 150 ml desztillált vízben szuszpendáljuk és a szuszpenzió tisztaságát az 1. példa szerint megvizsgáljuk. A sejtszuszpenziót olvadásban levő jégfürdőre helyezzük és „Branson Europa sonicator model J 22" ultrahangos berendezéssel szétroncsoljuk a sejteket. A roncsolás után a szuszpenziót 2 órán keresztül 2 550 ford/perc sebességgel 5 C°-on centrifugáljuk és így a sejttörmeléket eltávolítjuk. A felülúszó fázist 0,45 mikron hézagméretű steril szűrőn keresztül szűrjük, a kapott 100 ml szűrlet pH-ját N sósavoldattal 6,4-re állítjuk be. Az oldathoz 0,02% koncentráció biztosítására thiomersalt (etil-higany-tioszalicilsav) adunk. 4. példa 80 ml 3. példa szerint előállított szűrletet alaposan összekeverünk 4 ml 2%-os vizes Alhydrogel szuszpenzióval. Az enterotoxin Alhydrogelen történt adszorpcióját triklórecetsavas csapadékképzési próbával ellenőrizzük. A fehérjével közel azonos súlyú Alhydrogel az enterotoxin teljes mennyiségét adszorbeálta. A felülúszó 20 ml-ét elöntjük, a maradékot 10 ml-es ampullákba töltjük és az ampullákat lezárjuk. Az egyes ampullák folyadéktartalma (9 ml) megfelel a hőre érzékeny enterotoxin 100 mg-os szárazanyag-tartalmú egységadagjának. A vakcinát intramuszkulárisan vagy szubkután vemhes emséknek adhatjuk az elles előtt 3—6 héttel. Adott esetben az adjuvánssal ellátott vakcinát az egységadag egészszámú többszörösének megfelelő adagokban nagyobb ampullákba töltjük és így többszörös adagokat állítunk elő. 5. példa Megismételjük a 4. példában ismertetett eljárást, azzal a különbséggel, hogy az elegyet 100 db üvegampullába töltjük és az ampullákat lezárjuk. 3. példa Megismételjük az 1. példában ismertetett eljárást, azzal a különbséggel, hogy az E. coli ATCC 21 972-t a PP3 folyékony tápközegben 6 órán keresztül 37 C°-on inkubáljuk. Az egyes ampullák tartalma (0,9 ml) 10 mg-os 60 vakcinaadagnak felel meg, azaz az egyes ampullák 10 mg hőre érzékeny E. coli enterotoxin extraktum-szárazanyagot tartalmaznak. A vakcinát intramuszkuláris vagy szubkután úton vemhes kocáknak adhatjuk be' az elles előtt 65 3-6 héttel. 3
