169136. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dezoxi-amino-glükozidok előállítására amino-glükozidok dehidroxilezésével
169136 3 valamint a kanamicin típusú amino-glükozid antibiotikumok —amelyeknél a 2-dezoxi-sztreptamin 4- és 6-helyzetéhez cukormolekulák kapcsolódnak —, például a kanamicinek (így a kanamicin A, kanamicin B, kanamicin C), 3',4'-didezoxi-kanamicin B, gentamicinek (így a gentamicin Cla , gentamicin Ct , gentamicin C 2 , gentamicin A, gentamicin B, gentamicin B1; gentamicin D), tobramicin, és a szizomicin. Ide tartoznak a sztreptomicin típusú amino-glükozid antibiotikumok, például a sztreptomicinek (így a sztreptomicin, sztreptomicin B, dihidrosztreptomicin), hidroxisztreptomicin, bluenszomicin, és más típusú amino-glükozid antibiotikumok, például a desztomicinek (így a desztomicin A, desztomicin B), valamint a higromicin B. A "dezoxi-amino-glükozid antibiotikum" kifejezés alatt a kiindulási amino-glükozid antibiotikum dehidroxilezése útján kapott vegyületeket értjük a továbbiakban. így a kiindulási amino-glükozid antibiotikumok közé tartoznak önmagukban dezoxi-amino-glükozidok is, így például monodezoxi-amino-glükozidok és didezoxi-amino-glükozid antibiotikumok is." A találmány értelmében kiindulási vegyületekként foszforilezett amino-glükozid antibiotikumokat használunk. Ezek a vegyületek amino-glükozid antibiotikumok foszforilezése útján állíthatók elő. Az amino-glükozid antibiotikumok foszforilezését például úgy végezhetjük, hogy az amino-glükozid antibiotikumokat például a Pseudomonas aeruginosa vagy az Escherichia coli mikroorganizmusok által termelt foszfotranszferázt tartalmazó fermentlével, vagy e fermentlé feldolgozása útján kapott anyaggal érintkeztetjük valamilyen foszfát-donor jelenlétében. Az e célra felhasználható mikroorganizmusok közül megemlíthetjük az Escherichia coli Rll (FERM-P, ATCC-21990), Escherichia coli KI 2 ML 1629 [Journal of Antibiotics, 21, 1. szám, 22-29 (1968)], Escherichia coli ML 1401 Rmg/ [Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2, 3. szám 142-146 (1972)], Escherichia coli JR66/W677 [FEBS Letters, 14, 5. szám, 293 (1971)] és a Pseudomonas aeruginosa R34R (FERM-P No. 2124) mikroorganizmusokat. Az említett mikroorganizmusok valamelyikét szénforrásként glükózt, szacharózt és oldható keményítőt, nitrogénforrásként húskivonatot, élesztőkivonatot, kukoricalekvárt, aminosavakat, ammónium-szulfátot, ammónium-nitrátot és ammónium-kloridot, valamint szervetlen vegyületként magnézium-kloridot és nátrium-kloridot tartalmazó táptalajon tenyésztjük. A tenyésztést nyugvó, vagy aerób kevert tenyésztés formájában végezzük. A tenyésztés hőmérséklete 20-40 C°, előnyösen 28-37 C°. A táptalaj pH értéke 6-9, előnyösen 6,8-7,8. A tenyésztés ideje 2—7 2 óra, előnyösen 6-24 óra. Az így kapott fermentlét, vagy a fermentlé feldolgozása útján kapott anyagot - amelyek foszfotranszferázt tartalmaznak - használjuk az amino-glükozid antibiotikumok foszforilezésére. A fermentlé feldolgozása útján kapott anyag alatt bármely olyan, az amino-glükozid antibiotikum foszforilezésére képes anyagot értünk, amely a fermentlé feldolgozása, így például a fermentlé szűrése, centrifugálása, ultrahangos kezelése, szűrőprésen végzett dezintegrálása vagy bontó enzimek-5 kel végzett kezelése útján kapható. A foszforilezést 15 C° és 80 C°, előnyösen 30 C° és 40 C° közötti hőmérsékleten, 4 és 11, előnyösen 6 és 10 közötti pH értéken 10 perc és 48 óra előnyösen 1 óra és 48 óra közötti időn át 10 végezzük. A reakcióelegyben a kiindulási vegyületként használt aminoglükozid antibiotikum koncentrációja előnyösen 0,01—100 mg/ml, míg a reakcióelegy 1000 térfogatrészére vonatkoztatva nedves micéliumban kifejezve 1—50 rész; fermentlét, 15 vagy a fermentlé feldolgozása útján kapott anyagot használunk. A reakcióelegyhez foszfát-donort, promotort (a reakciósebességet gyorsító anyagot) és enzimstabilizátort adhatunk. Bizonyos esetekben azonban 20 nem szükséges foszfát-donort adagolni, tekintettel arra, hogy az alkalmazott sejtek vagy micéliumok általában tartalmaznak foszforvegyületeket, és így foszfát-donorként hatnak. Foszfát-donorként megemlíthetjük az adenozin-25 -trifoszfátot, adenozin-difoszfátot, dezoxi-adenozin-trifoszfátot, dezoxi-adenozin-difoszfátot, citidin-trifoszfátot, guanozin-trifoszfátot és az uridin-trifoszfátot. Promotorként a kálium-kloridot, nátrium-kloridot, ammónium-kloridot, lítium-kloridot, 2-mer-30 kapto-etanolt, ditio-treitolt és a ciszteint, míg enzimstabilizátorként a mannitot, szorbitot, glicerint, ammónium-szulfátot és a szacharózt említhetjük meg. Kívánt esetben a reakcióelegyhez még más 35 fémsókat, így például magnézium-kloridot, magnézium-szulfátot, magnézium-kloridot, mangán-kloridot, kobalt-kloridot, cink-kloridot, vas(H)-kloridot, vagy nikkel(II)-kloridot is adhatunk. A foszforilezés során az amino-glükozid anti-40 biotikum egy vagy több hidroxilcsoportját foszforilezzük. A foszforilezett hidroxilcsoportot a továbbiakban egyes esetekben „foszfonoxicsoport"-ként fogjuk nevezni. A foszfonoxicsoportok helyzete az amino-glükozid antibiotikumok 45 típusától és a foszforilezés körülményeitől, de különösen az alkalmazott foszfotranszferáz milyenségétől függ. A foszfonoxicsoport lehet helyettesítetlen foszfonoxicsoport (—OP03 H 3 ), helyettesített foszfonoxicsoport, így például nukleotidil-fosz-50 fonoxicsoport (azaz például adenozil-foszforioxi-, uridil-foszfonoxi-, 5'-inozinil-foszfonoxi- vagy 5'-guanozil-foszfonoxicsoport) vagy alkil-foszfonoxicsoport (azaz például dimetil-foszfonoxi-, dietil-foszfonoxi-, metil-foszfonoxi- vagy etil-foszfonoxi-55 csoport). Az így előállított, foszforilezett amino-glükozid antibiotikum elkülönítése a reakcióelegyből önmagában ismert módon, így például extrakció, kicsapatás, liofilizálás vagy ioncserélő gyantával, 60 ioncserélő cellulózzal vagy aktív szénnel töltött oszlopon végzett kromatografálás útján végezhető. Az így foszforilezett amino-glükozidokat használjuk a találmány szerinti eljárásban kiindulási vegyületekként, éspedig először halogénezzük őket. 65 Mielőtt azonban valamely vegyületet halogénez-2
