169120. lajstromszámú szabadalom • Eljárás stabil víruskészítmények előállítására
3 169120 4 legföljebb 40 000, előnyösen körülbelül 10 000 — 40 000 átlagos molekulasúlyú polivinil-pirrolidonnal. A polivinil-pirrolidon alkalmazásával kiküszöbölhetjük az állati fehérjék használatából származó hátrányokat, a polivinil-pirrolidon ugyanis 5 lényegében nem reakcióképes, a szervezetbe jutva allergen hatást nem vált ki [lásd a Bull. Par. Drug Ass. 23, 124-131 (1969) közleményben ismertetett plazma-transzfúziós vizsgálatokat], és — a kereskedelmi forgalomba kerülő termékekkel szemben 10 támasztott szigorú minőségi követelményeknek eleget téve — minden lehetséges szennyezőanyagtól mentes. Polivinil-pirrolidont már korábban is alkalmaztak a gyógyszergyártásban különböző célokra, és már 15 ismertették azt is, hogy a polivinil-pirrolidon bizonyos mértékű vírusgátló hatással is rendelkezik [B. S. Michaels és munkatársai: Nature 212, 101-102 (1966)]. A polivinil-pirrolidon alkalmazását sejthez kötött vírusok sejtmentes preparátu- 20 mainak stabilizálására azonban eddig még nem ismertették és nem javasolták. A fentieknek megfelelően a találmány tárgya eljárás az FC—126 pulyka-herpesvírus (ATCC Vr No. 584) vagy a The Wistar Institute törzsgyűjte- 25 menyben „Temple" néven letétbe helyezett varicella zoster vírustörzs életképes, stabil szuszpenziójának vagy liofilizátumának előállítására valamely ke ményítő-származékot, glutaminsav-alkálifémsót vagy -alkáliföldfémsót, kétvegyértékű fémkationok- 30 kai kelátot képező anyagot és pufferanyagét tartalmazó stabilizálószer felhasználásával, sejthez kötött ATCC Vr No. 584 vírustörsszel megfertőzött csirkeembrió-kötőszövet-sejtekből, illetve „Temple" vírustörzzsel megfertőzött WI 38 sejtekből kiin- 35 dúlva. A találmány értelmében a sejteket 0,1 - 10%, legföljebb 40 000 átlagos molekulasúlyú (előnyösen körülbelül 10 000 - 40 000 átlagos molekulasúlyú) polivinil-pirrolidont, 2-10% keményítő-származékot 40 (például szacharózt), 0,05 - 0,2% glutaminsav-alkálifémsót vagy -alkáliföldfémsót (például nátrium-glutamátot) és 0,1 -0,5%, kétvegyértékű fémkationokkal kelátot képező anyagot (például etiléndiamin-tetraecetsavat, dietiléntriamin-pentaecetsavat 45 vagy citromsav-alkálifémsót, célszerűen nátrium-etiléndiamin-tetraacetátot) tartalmazó, pufferolt, 6,5 és 7,5 közötti pH-értékű vizes oldattal keverjük össze, a kapott, legalább 104 sejt/milliliter koncentrációjú szuszpenzióban ismert módon elroncsoljuk 50 a megfertőzött sejteket, majd a felülúszóként kapott szuszpenziót, amely a felszabadult életképes érintetlen vírusokat tartalmazza, elválasztjuk az üledékként kivált elroncsolt sejtanyagtól, és ezt a vírus-szuszpenziót kívánt esetben ismert módon lio- 55 filizáljuk. A stabilizáló oldatot célszerűen foszfát-pufferrel, például 0,1 mólos Na2 HP0 4 /NaH 2 P0 4 pufferrel (pH = 7), 0,05 mólos KH2 P0 4 /NaOH pufferrel (pH = 7), vagy, előnyösen, 0,1 mólos KH2 P0 4 / 60 /Na2 HP0 4 pufferrel (pH = 7) pufferoljuk. A találmány szerint felhasznált stabilizáló kompozíciók nemcsak a sejtből történő kivonás során, hanem a következő Uofílizálási lépés és a tárolás alatt is stabilizálják a sejtmentes vírusokat. Ennek 65 megfelelően a kapott életképes, stabil vírus-szuszpenziók a vakcinakészítés ismert módszereivel, például liofilizálással életképes, száraz és tárolható stabil víruskészítményekké alakíthatók. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. A példákban a pulykákból elkülönített B-csoportbeli herpesvirus (FC-126, más néven ATCC Vr No 584 vírustörzs) és a varicella zoster vírus (a The Wistar Institute Intézetben „Temple" néven deponált törzs kezelését írjuk le. 1. példa Specifikus patogén-mentes tenyészetből (Wickam Labs, Nagy-Britannia) származó 10 napos csirke-embriókat aprítunk és tripszinezünk. A tripszinezett sejteket összegyűjtjük, és 0,84 g/liter glükózzal, 2,5 g/liter laktalbumin-hidrolizátummal, 1,5 g/liter triptóz-foszfát táptalajjal (DIFCO Labs., Detroit 1, Michigan, Amerikai Egyesült Államok) és 50 ml/liter inaktivált borjúszérummal kiegészített Earle-féle alap-táptalajban (növesztő táptalaj) centrifugáljuk. Centrifugálás után a sejteket egyesítjük, a fenti összetételű növesztő táptalajban szuszpendáljuk, és 4 literes termelő lombikokban négy csirke-embrió kötőszövet-tenyészetet készítünk. 37 C°-on végzett 2 napos inkubálás után, amikor egybefüggő sejt-egyréteg alakult ki, a tenyészeteket mikroszkóp alatt megvizsgáljuk, a növesztő táptalajt eltávolítjuk, és azonos térfogatú fenntartó táptalajjal helyettesítjük. A fenntartó táptalaj 0,84 g/liter glükózzal, 2,5 g/liter laktalbumin-hidrolizátummal, 0,6 g/liter triptóz-foszfát-táptalajjal (DIFCO Labs., Detroit 1, Michigan, Amerikai Egyesült Államok), 20 ml/liter inaktivált borjúszérummal, 5 g/liter hidrokortizonnal és 50 mg/liter neomicin-bázisnak megfelelő mennyiségű neomicin-szulfáttal kiegészített Earle-féle alap-táptalaj. A lombikokat FC-126 pulyka herpesvírus-törzzsel (ATCC Vr. No 584) oltjuk be, és 37 C°-on inkubáljuk. A vírus elkülönítése során a tenyészetek felső folyadékfázisát elöntjük, és a megfertőzött egyrétégeket tripszin — nátrium-etiléndiamin-tetraacetát oldattal elkülönítjük. A megfertőzött sejteket egyesítjük, centrifugáljuk, majd négy egyenlő részletre osztjuk. Egy-egy így kapott anyag-részletet (amely egy lombikban termelődött mennyiségnek felel meg) 10-10 ml, az 1. táblázatban felsorolt stabilizáló kompozícióban szuszpendálunk, és a sejtszuszpenziókat 2 percig ultrahang-besugárzással kezeljük. Ultrahang-forrásként Branson Europa sonicator modell J 22 készüléket (a Branson Europa N. V. cég, Soest, Hollandia gyártmánya) használunk, a készüléket maximális energiára kapcsoljuk. A kezelt szuszpenziókból elemzés céljára mintát veszünk, és a szuszpenzió maradékát liofilizálás előtt —70 C°-on tároljuk. A vírus-titrálás céljára elkülönített mintákat két 24 órás csirke-kötőszövet tenyészetre oltjuk, a 0,1 ml térfogatú inokulumot 45 cm2 felületen oszlatjuk el, és SPG közeggel hígítjuk. Az inokulumot a fenntartó közeggel való elegyítés előtt 30 percig 2
