168883. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2-szubsztituált- 4-hidroxi-ciklopentán-1,3-dionok előállítására
5 168883 6 inkubátorba helyezzük és 25C°-on egy hétig inkubáljuk. Ezt követően a lemezeket kiemeljük és 15 ml steril desztillált vizet adunk hozzájuk. A spórákat és a vegetatív tenyészetet steril tűk segítségével az agáron fellazítjuk. A szuszpenziót 50 ml szója-dextróz táptalajt tartalmazó edénybe visszük, majd ezt rotációs rázógépre helyezzük és 25 C°-on 24 óra hosszat 210 fordulat/perc sebességgel rázzuk. E kezdeti szakasz után 5-5 ml-t háromféle táptalajt tartalmazó 2-2 edénybe viszünk. (Táptalajok: szója-dextróz, keményítőcukor-Edamine és dextróz-kukoricalekvár). Az edényeket rázógépre helyezzük, majd 24-28 óra hosszat 25 C°-on rázzuk. 25 mg 2-szubsztituált ciklopentán-l,3-4-trion-nak 0,25 ml dimetilformamiddal készült oldatát adjuk az edénypárok egyikéhez. A kontroll edényekhez 0,25 ml dimetilformamidot adunk. Az edényeket további 24 óra hosszat rázatjuk. Ezt követően a pH értéket megmérjük, az edények tartalmát 6n sósav-oldattal 2 pH értékre savanyítjuk és azonos térfogatú etilacetáttal extraháljuk. Az extraktumok oldószer-tartalmát 60 C°-os vízfürdőn eltávolítjuk. A maradékot l-l ml acetonban feloldjuk, majd vékonyréteg-kromatográfiával vizsgáljuk. A mintákat szilikagélG lemezeken megfelelő oldószer alkalmazásával kromatografáljuk. Oldószerként célszerűen etilacetát-ecetsav-izooktán-H2 110 : 20 : 50 :100 arányú elegyét alkalmazzuk. A kifejlesztés után a lemezeket ultraibolya fény alatt hívjuk elő. Az egyes vegyületek Rf értékeit az alábbi táblázat foglalja össze. Kukoricalekvár-dextrin A VI képletű vegyület Az I képletű vegyület A VII képletű vegyület A VIII képletű vegyület A IX képletű vegyület Rf értéke: 0,57 Rf -értéke: 0,48 Rf értéke: 0,32 Rf értéke: 0,18 Rf értéke: 0,09 Az eljárás során az alábbi összetételű táptalajokat alkalmaztuk: Szója-dextróz szójabab magbél 5g dextróz 20 g NaCl 5g dikáliumhidrogénfoszfát 5g élesztő 5g víz 1 liter pH: 7 A táptalajt 15 percig 1 atm. nyomáson autoklávban hőkezeljük. Keményítőcukor-Edamjn keményítőcukor (nyers szőlőcukor) 50 g Edamin* 20 g kukoricalekvár 5 ml víz 1 liter pH: 7 + Tejfehérje enzimatikus hidrolízis terméke (Sheffield Fars Co.) 40 45 50 55 60 65 dextrin 10g kukoricalekvár 80 g káliumdihidrogénfoszfát lg nátriumklorid 5g víz 1 liter 10 pH: 7 A táptalajt 1 atm. nyomáson 30 percig autoklávban hőkezeljük. Az alábbi vizsgálati eljárást és fermentációs pél-15 dákat illusztrálás céljára adjuk meg. Az alkalmazott mikroorganizmusokon túlmenően más, a redukcióhoz alkalmas, mikroorganizmusokat is felhasználhatunk. A táptalajhoz alkalmazott nitrogén- és szénforrás a megadottaktól eltérhet. A táptalajhoz 20 felhasználhatunk kukoricalekvárt, húskivonatot, proteinhidrolizátumot, vagy szacharózt, glukózt, maltózt, keményítőt, melaszt használhatunk például a dextrin helyett. A fermentáció egyéb körülményeit is kívánt esetben megváltoztathatjuk. A 25 táptalaj pH-ja 5 és 7,5 között változhat. A beadagolt anyag mennyiségét és a keverés sebességét is változtathatjuk. Az (I) általános képletű kiindulási vegyületeket 30 Katsube és Matsui módszerével [Agr. Biol. Chem. 33, 1078-1086 (1969)] állítjuk elő. A példák szerint előállított termékeket ultraibolya, infravörös, mágneses magrezonancia, vé-35 konyréteg-kromatográfia segítségével vizsgáltuk. 1. példa 2-(6'-metoxikarbonil-hexil)-4R-hidroxi-ciklopentán-l,3-dion előállítása. (II) képletű vegyület) A) Fermentáció Agarlemezen tenyésztett Dipodascus uninucleatus (ATCC 7445) egyhetes felületi tenyészetét 5 ml 0,85%-os só-oldatban szuszpendáljuk. A szuszpenzió 2-2 ml-es részleteit a fentiekben leírt szójabab-dextróz táptalaj 50 ml-es részleteit tartalmazó 250 ml-es Erlenmeyer-lombikhoz adjuk. (Fj lépés). Az edényeket 25 C°on rázógépen (250 fordulat/perc • 2" szög) 24 óra hosszat inkubáljuk. Ezt követően az elegy 10%-át négy 2-2 literes Erlenmeyer-lombikba visszük. (F8 lépés), A 2 literes lombikok 500-500 ml szójabab-dextróz táptalajt tartalmaznak. A tenyészetet 24 óra hosszat rotációs rázógépen inkubáljuk, majd 250 mg 2-(6'-karbO-metQxi-hexü)-ciklopentán-l,3,4-trion (I képletű vegyület) 2 ml dimctüformamiddal készült oldatát adjuk minden egyes edényhez. Az I képletű vegyületet Katsube és Matsui [J. Agr. Biol. Chem. 33. 1078. (1969)] Írják le. Az Fa lépéshez tartozó edényeket további 24 óra hosszat az Fi lépéshez hasonló körülmények között inkubájjuk. 3
