168849. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükoprotein-elegy előállítására

5 168849 6 több-dózisú fiolában, szublingvális tabletta formájában, enteroszolvens bevonatú tabletta, aerosol, krém, kenőcs, kúp formájában alkalmazhatjuk ezeket. A hatásos dózis nagymértékben függ a kezelendő eset súlyosságától és az alkalmazott gyógyszerformától. A találmányt az alábbi példák illusztrálják. Kiindulási anyag előállítása. 1. Baktériumkivonat előállítása. A kiválasztott baktérium-törzset (Klebsiella pneumoniae, törzsszám: 52145, Pasteur Intézet, Párizs) megfelelő táptalajban, egy fermentorban tenyésztjük. A tenyésztést addig folytatjuk, amíg a táptalaj ml-enként 120 milliárd csirát tartalmaz. A tenyésztés befejeztével a mikroorganizmusokat 8 napig sejtbomlásnak vetjük alá, amíg a szuszpenzió stabillá válik. Az elbontott sejteket tartalmazó szuszpenziót ezt követően betöményítjük, a lipidektől dimetoxi-metán-metanol 4:1 arányú elegyével megszabadítjuk. A centrifugálás után visszamaradó maradékot metanollal mossuk, vízzel felvesszük és formaldehiddel elegyítjük. Az extraktumot egy végső lecsapással tisztítjuk, 1 rész extraktum lecsapolásához a metilál-metanol 4:1 arányú elegyét alkalmazva, majd a csapadékot metanollal mossuk. 2. A baktériumkivonat tulajdonságai. A fentiek szerint kapott kivonat áttetsző és vizes közegben oldható, 15C°-on, 10%-os (súly/térfogat) triklórecetsawal 7-es pH-jú 0,6 n perklórsavas vagy 4,6 mólos ammóniumszulfát oldatban nem csapható le. Mangánszulfát-oldat vagy cetilpiridiniumklorid hozzáadására részleges lecsapódás mutatkozik. A baktériumkivonat fő összetevőit megvizsgálva 26-32% hexóz-tartalmat és 6,2% a-amino-nitrogént mértünk. Példa A fentiek szerint Klebsiella pneumoniae tenyészetéből nyert 2 g glükoprotein-elegyet 400 ml vízben oldunk fel. Ezt az oldatot AMICON XM 300-as membránnal lezárt dialízis cellába visszük. Az oldatot enyhe nyomás alatt (0,7 at) állandó keverés közben tartjuk. A dialízis előrehaladásával a dializált oldat térfogatát pótoljuk. E célból azonos térfogatú desztillált vizet adunk hozzá. Ezt a műveletet mindaddig folytatjuk, amíg a leszűrt oldat térfogata a kezdeti térfogatnak legalább tízszerese. A cellában maradó sejteket összegyűjtjük, majd 6B jelzésű Szefaróz gélen kromatografáljuk, a Szefaróz gélen meg nem kötött frakciót összegyűjtjük és liofilizálással szárítjuk. A műveletet több lépésben is elvégezhetjük először AMICON PM 30-as membránnal, ezt követően AMICON X 50-es membránnal, majd harmadszor AMICON XM 300-as membránnal diahzálunk, a cellában maradó oldatot 6G jelzésű Szefaróz gélen kromatogratáljuk: a gélből kizárt oldat liofilizálásával a fentiekkel azonos glükoprotein-elegyet kapunk. Az XM 300-as membránon visszatartott és a 6B 5 jelzésű Szefaróz gélről kizárt glükoproteinek molekulasúlya 1 milliónál nagyobb. Ezek a makro-molekuláris anyagok magasabb hexóz-tartalommal rendelkeznek, mint az előbbiekben említett szabadalmi leírás szerint előállított kevésbé tiszta 10 frakció. A hexóz-tartalom általában 62%. Az a-amino-nitrogén-tartalom kicsi (1,6%). A glükoproteinek 8 mólos karbamid-oldattal, vagy redukáló oldattal kezelve csak részben disszociáltak. A dialízis során eltávolított alacsony mo-15 lekulasúlyú vegyületeket tartalmazó oldatból a disszociáltató szert eltávolítva, a vegyületeket ismét asszociálhatjuk. Az így kapott „de novo" makromolekulák különböznek azoktól a glükoproteinektől, amelyek az AMICON XM 300-as membránon 20 fennmaradnak. A kapott glükoproteineket különböző enzimek hatásának (pronáz, tripszin, Pankreatin, hialuronidáz) kitéve, majd membrán segítségével frakcionálásnak alávetve, azt tapasztaljuk, hogy a makromolekuláknak csak egy kis része 25 érzékeny ezekre az enzimekre és a farmakológiai hatás számottevően nem változik. A fentiekben leírt tisztítási eljárás hozama 30-35% között változik. A glükoproteinek 62% hexózt tartalmaznak, a protein-tartalom 9% körül 30 van. A hexóz/protein arány mintegy 7. (Az értékelést megnehezíti az a körülmény, hogy az orcinos befújáshoz standardként nem a glükoprotein-elegyben ténylegesen jelenlevő cukrokat, hanem galaktózt és mannózt alkalmaztunk.) 35 Szerkezet A molekula-összetevőket vákuumban végzett savas hidrolízissel és cellulóz lapon végzett szétválasz-40 tással vizsgálhatjuk. Ilyen módon számos aminosavat azonosíthatunk, amelyek révén a glükoproteineket a peptido-glükánoktól és ozaminoktól megkülönböztethetjük. A szénhidrátok közül glükóz, galaktóz és mannóz jelenléte mutatható ki. 45 Ribóz nem mutatható ki. Lúgos hidrolízis után - amely az O-ozidil-kötés megbontásához vezet — a bomlástermékek vizsgálata azt mutatja, hogy a hosszú glikánláncok rövid proteinláncokhoz kötődnek. (O-ozidil kötésen ami-50 nosav /3-hidroxilcsoportja és egy szénhidrát alkohol csoportja 0 atomon keresztül történő kötését értjük). A fentiek szerint kapott glükoprotein molekulára jellemző, hogy makromolekuláris természetű, 55 a fehérje és zsírbontó enzimekkel (lipáz, Pankreatin) szemben ellenálló. Minthogy cetilpiridinium-kloriddal nem ad csapadékot, a mukopoliszacharidokkal nem azonos. A 8,2 pH-jú barbitursavas-nátrium-puffer jelen-60 létében végzett elektroforetikus vizsgálat egy

a~ß mobilitás-csúcsot mutat, vagyis a vizsgált anyagnak az elektroforézis során mutatott mozgékonysága megegyezik az összehasonlító anyagként alkalmazott glükorproteinek elektroforetikus mozgékony-5 ságával. 3