168825. lajstromszámú szabadalom • Javított mikrobiológiai eljárás 2-helyzetben szubsztituált 4(R-)-hidroxi- ciklopentán - 1,4-dion-származékok előállítására
7 168825 8 literes Fernbach-lombikba. 24 órás inkubálás után, amikor is a növekedés legalább 25%-nyi szilárd anyagot ér el az inkubációs közeg térfogatára számolva mindegyik Fernbach-lombikba 0,4 g 2-(6'-karbometoxihexil)-ciklopentán-l ,3,4-triont adagolunk por-alakban, 8 óránként, 3 napon át. Az átalakulás folyamán a pH-t 4,2-4,5 között tartjuk 1 mólos káliumdihidrogénfoszfát adagolásával, a glükóz-koncentrációt pedig 0,1-0,4%-on tartjuk úgy, hogy az elhasznált mennyiséget egyszerre adjuk hozzá. A 2-(6'-karbometoxihexil)-ciklopentán-1,3,4-trion átalakulását 2-(6'-karbometoxihexil)-4--(R)-hidroxi-ciklopentán-l,3-dionná úgy állapítjuk meg, hogy egy kis mintát időnként 0,5 térfogatnyi etilacetáttal extrahálunk, a maradékot , acetonban szuszpendáljuk és vékonyrétegkromatográfiának vetjük alá, ahol is a lap eluálására a következő oldószerrendszert alkalmazzuk: 110 ml etilacetát + 50 ml izooktán + 20 ml ecetsav. A szubsztrátumot és a termékfoltokat rövidhullámú ultraibolya sugárzással határozzuk meg. Az első szubsztrátum-adagolást követő 72 órával leszűrjük a sejteket. A felső réteget nátriumkloriddal telítjük, majd sósavval pH=-2,0-ig savanyítjuk és 1 térfogatnyi etilacetáttal extraháljuk. Az etilacetátos fázist elválasztjuk és Az etilacetátos fázist elválasztjuk és szárazra pároljuk. Etilacetát-petroléteres átkristályosítás után 2,8 g végterméket kapunk. Op: 80-86 C°, MD5 = + 20 > 3 (kloroform). Ha 2-(6'-karbometoxihexii)-ciklopentán-l,3,4--trion szubsztrátum helyett 2-(6'-karbometoxihexil)-3-metoxi-ciklopent-2-én-l,4-diont alkalmazunk, úgy a fentihez hasonló termeléssel jutunk 2-(6'-karbome toxihexil)-4-(R)-hidroxi-ciklopentán-l ,3-dionhoz. 2. példa: Az 1. példa szerint járunk el, ugyanazt a tápközeget alkalmazzuk, csakhogy 14 literes fermentorral dolgozunk. A Dípodascus uninucleatus (ATCC száma: 7445) 1 literes, 24 órás, 2,8 literes Fernbach-lombikban levő tenyészetet használjuk fel a 14 literes fermentorban levő 9 liternyi tápközeg beoltására. A fermentáció reakciókörülményei a következők: hőmérséklet: 30 C°, levegőztetés: 5 liter levegő/perc, keverés: 300 fordulat/perc. Szükség esetén a habképződés megakadályozására habzásgátlót (Antifoam 130S) használunk. 24 órás inkubálás után 4g 2-(6'-karbometoxihexil)-ciklopentán-l,3,4-triont adagolunk por alakban, 8 óránként, a következő 72 órában. Az átalakulás folyamán a közeg pH-ját 4,2-4,5-ön tartjuk, 1 mólos káliumdihidrogénfoszfát adagolásával, a glükóz-koncentrációt pedig 0,1-0,4%-on tartjuk, úgy, hogy az elhasznált mennyiséget egyszerre adjuk a reakcióelegyhez. Az. első szubsztrátum adagolást követően 72 órával leszűrjük a sejteket és a terméket, a 2-(6'-'karbometoxihexil)4(R)-hidroxi-ciklopentán-l,3-diont az 1. példa szerint izoláljuk. Az átkristályosított termék kitermelése 25,0 g. op: 89,5-91 C°. MD = + í9 > 1 (kloroform). Ha szubsztrátumként e példában 2-(6'-karbometoxihexil)-3-metoxi-ciklopent-2-én-1,4-diont alkalmazunk, úgy hasonló kitermeléssel jutunk a végtermékhez. 3. példa: A 2. példa szerint járunk el, azzal a különbség-10 gel, hogy 10g-nyi szubsztrátumot 20 ml dimetilformamidban oldunk, és ezt folyamatosan adagoljuk fermentátorban 0,5 g/óra sebességgel. Az adagolást úgy oldjuk meg, hogy teflon csövet kapcsolunk egy fecskendező szivattyúhoz, hogy 15 megakadályozzuk a dimetüformamid konózios hatását a tygon vagy gumicsövekre. A folyamatos adagolás esetén az átalakulás foka jóval nagyobb, mint az egyszeri adagolás esetében: 36 g 60 óra alatt, míg az egyszeri adagolásnál: 36 g 70 óra 20 alatt. Szabadalmi igénypontok: 25 1- Javított mikrobiológiai eljárás valamely III általános képletű 2 helyzetben szubsztituált 4(R)-hidroxi-ciklopentán-l ,3-dion-származék előállítására — ahol a képletben 30 L jelentése etilén- vagy vinilén-csoport, M Jelentése 1—4 szénatomos alkil-csoport, j és k jelentése egész szám 0-tól 4-ig — az I vagy II általános képletű szubsztrátumból 35 — ahol L, M, j és k jelentése a fenti — az Ascomycetes osztályba tartozó Dipodascus uninucleatus (ATCC: 7445) mikroorganizmus segítségével, az alkalmazott mikroorganizmust 2—6% szénhidrátot tartalmazó, 5—6 pH-jú közegben inkubálva, 40 azzal jellemezve, hogy az inkubálás folyamán a tápközeg szénhidrát-koncentrációját 0,1—1,0%-on, a pH-t pedig 4 és 5 között tartjuk mindaddig, amíg a tápközegben a mikroorganizmus sejtkoncentrációja 20—35%-ra emelkedik, a szubsztrátumot ezu-45 tán —10 liter tápközegre vonatkoztatva — 0,4—1,0 g/óra sebességgel a tápközeghez adagoljuk, miközben a tápközeg szénhidrát-koncentrációját 0,1-1,0%-on, a pH-t pedig 4 és 5 között tartjuk, majd izoláljuk a végterméket. 50 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy I. általános képletű szubsztrátumként 2-(6'-metoxikarbonil-hexil)-ciklopentán-1,3,4-triont alkalmazunk. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási 55 módja, azzal jellemezve, hogy II általános képletű szubsztrátumként 2-(6'-metoxikarbonil-hexil)-3-metoxi-ciklopent-2-én-l ,4-diont alkalmazunk. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a szubsztrátum 60 adagolását — 10 liter tápközegre vonatkoztatva — 0,5 g/óra sebességgel végezzük. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a tápközeg szénhidrát-koncentrációjaként 0,1%-ot, szénhidrátként pe-65 dig glükózt alkalmazunk. 4
