168825. lajstromszámú szabadalom • Javított mikrobiológiai eljárás 2-helyzetben szubsztituált 4(R-)-hidroxi- ciklopentán - 1,4-dion-származékok előállítására

168825 A HI általános képletű vegyületben a vonalkázott kötés a 4-es szénatom és az oxigénatom között arra utal, hogy a 4-hidroxil-csoport vegyértékkötésének iránya a gyűrű síkja alá mutat, ami szerkezetileg, a Cahn-Ingold-Prelog konvenció értei- 5 mében az R-konformációt jelenti. Sih és munkatársainak az eljárását egy még ennél is specifikusabb példa illusztrálja, nevezetesen a IV képletű 2-(6'-karbometoxihexil)-ciklopentán-1,3,4-trion-szubsztrátum vagy az V képletű 10 2 - (6 '-karbometoxihexil)-3-metoxi-ciklopent-2-én-1,4--dion-szubsztrátum átalakítása a VI képletű 2-(6'-karbometoxihexil)-4(R.)-hidroxi-ciklopentán-l,3--dionná a Dipodascus uninucleatus vagy Schizosaccharomyces pombe fermentációs hatására. 15 A VI képletű vegyületben a vonalkázott kötés a 4-es szénatom és az oxigénatom között arra utal, hogy a 4-hidroxil-csoport vegyértékkötésének iránya a gyűrű síkja alá mutat, ugyanúgy, mint a III általános képletű vegyület esetében. 20 A Sih és munkatársai-féle eljárás specifikus körülményei a következők: 1. szója-dextróz, keményítőcukor-edamin vagy dextrán-kukoricalekvár közeg alkalmazása, ahol a 25 kiindulási szénhidrát-koncentráció 0,1-0,5% és a kiindulási pH = 5-7, 2. az Ascomycetes (nevezetesen Endomycetales, Mucorales, Moniliales vagy Eurotiales rendbe tartozó) mikroorganizmusok inkubálása a közegben 30 mindaddig, míg elérjük a 10%-os mikroorganizmus-koncentrációt, 3. ezután 2-helyzetben szubsztituált 1,3,4-trión vagy 2-helyzetben szubsztituált 3-alkoxi-ciklopentán-l,4-dion adagolása a közeghez, körülbelül 35 0,2g(óra)10 liter közeg sebességgel, 4. a 2-helyzetben szubsztituált 4(R)-hidroxi-ciklopentán-l,3-dion etilacetátos extrakcióval történő kinyerése a közegből. 72 órás átlagos reakció esetén körülbelül 5 g 40 szubsztrátum/10 liter közeg alakítható át végtermékké. Fontos megjegyeznünk, hogy a Sih és munkatársai féle eljárás nem tartalmazza azt a tényt, hogy fontos a szénhidrát-koncentráció vagy a 45 közeg pH-jának állandó értéken tartása a mikroorganizmus inkubációs ideje vagy a szubsztrátum adagolás ideje alatt. A találmány szerinti javított mikrobiológiai eljárás 2-helyzetben szubsztituált 4(R)-hidroxi-ciklo- 50 pentán-1,4-dion-származékok előállítására valamely, 2-helyzetben szubsztituált ciklopentán-l,3,4-trion vagy valamely, 2-helyzetben szubsztituált 3-alkoxi-ciklopent-2-én-l,4-dion-szubsztrátumból, az Ascomycetes osztályba tartozó Dipodascus unime- 55 leatus (ATCC 7445) mikroorganizmus segítségével, oly módon, hogy az alkalmazott mikroorganizmust 2—6% szénhidrátot tartalmazó, 5—6 pH-jú tápközegben inkubáljuk és az inkubálás folyamán a tápközeg szénhidrát-koncentrációját 0,1-1,0%-on, a 60 pH-t pedig 4 és 5 között tartjuk mindaddig, míg a tápközegben a mikroorganizmus sejtkoncentrációja 20-35%-ra emelkedik, a szubsztrátumot ezután -10 liter tápközegre vonatkoztatva- 0,4-1,0g/óra sebességgel a tápközeghez adjuk, miközben a 65 tápközeg szénhidrát-koncentrációját 0,1-1,0%-on, a pH-t pedig 4 és 5 között tartjuk. A találmány szerinti javított eljárás a következő lépésekből áll: 1. Az alkalmazott mikroorganizmust 2—6% glükózt, kazaminosavakat, élesztőkivonatot, meghatározott lényeges ásványi sókat, például nátriumcitrátot, káliumdihidrogénfoszfátot, ammóniumnitrátot, magnéziumszulfátot és kalciumkloridot tartalmazó, 4—5 pH-jú tápközegben inkubáljuk és az inkubálás folyamán a tápközeg glükóz-koncentrációját 0,1—1,0%-on a pH-t pedig 4-5 között tartjuk mindaddig, míg a tápközegben a mikroorganizmus koncentrációja 20-35%-ra emelkedik. 2. a tápközeghez ezután az I vagy II általános képletű szubsztrátumot adjuk - 10 liter tápközegre vonatkoztatva— 0,4-1,0g/óra sebességgel, 3. a tápközeg glükóz-koncentrációját eközben 0,1-1,0%-on tartjuk vagy úgy, hogy az elhasznált mennyiséget egyszerre adjuk hozzá, vagy pedig folyamatos adagolással, 4. a tápközeg pH-ját az egész eljárás folyamán 4 és 5 között tartjuk. A találmány szerinti javított eljárást a következő részletes példán mutatjuk be, amelyben 2-(6'-karbometoxihexil)-ciklopentán-l,3,4-triont vagy 2-(6'-karbometoxihexil)-3-metoxi-ciklopent-2-én-l,4-diont fermentatív úton átalakítunk 2-(6'-karbometoxihexil)-4-(R)-hidroxi-ciklopentán-l,3-dionná a Dipodascus uninucleatus ATCC 7445 mikroorganizmus segítségével: 1. A mikroorganizmust olyan tápközegben inkubáljuk, amely 3 g nátriumcitrátot, 5 g vízmentes káliumdihidrogénfoszfátot, 3 g vízmentes ammóniumnitrátot, 0,2 g magnéziumszulfát-heptahidrátot, 0,1 g kalciumklorid-dihidrátot, 5 g élesztőkivonatot, 5 g kazaminosavakat (savval hidrolizált kazein, Difco Lab. Detroiti, katalógus száma: 0230-01) 40 g glükózt és 1 liter vizet tartalmaz, és amelynek a pH-ja 5-6, és az inkubálás folyamán a tápközeg glükóz-koncentrációját 0,1%-on, a pH-t pedig 4,2—4,7 között tartjuk mindaddig, míg a tápközegben a mikroorganizmus koncentrációja az inkubációs közeg térfogatára számolva 25%-ra emelkedik. 2. A tápközeghez ezután hozzáadjuk a fentiekben említett szubsztrátumot — 10 liter tápközegre vonatkoztatva — 0,5 g/óra sebességgel. 3. A tápközeg glükóz-koncentrációját eközben 0,1%-on tartjuk úgy, hogy az elhasznált mennyiséget egyszerre adjuk hozzá. 4. A tápközeg pH-ját az egész eljárás folyamán 1 mólos káliumhidrogénfoszfát adagolásával 4,2-4,7 között tartjuk. E javított eljárás átlagos 72 órás reakciója után 35-75 g szubsztrátum/10 liter közeg alakul át a fenti végtermékké. Az Ascomycetes osztályba tartozó következő mikroorganizmusok is alkalmazhatók a 2-helyzetben szubsztituált ciklopentán-l,3,4-trionok vagy a 2-helyzetben szubsztituált 3-alkoxi-ciklopent-2-én-1,4-dionok átalakítására 2-helyzetben szubsztituált 4(R)-hidroxi-ciklopentán-l,3-dionná, ezen eljárások azonban nem képezik a találmány tárgyát. 2