168778. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gentamicin-tipusú antibiotikumok előállítására
9 168778 10 elválasztását az előzőekkel megegyező bonyolult tisztítási lépések után szilikagél kromatográfiával, metanol helyett izopropanolt alkalmazva oldják meg. Vizsgálataink során azt találtuk, hogy a Micromonospora purpurea var. nigrescens által termelt valamennyi antibiotikum igen egyszerű és gazdaságos módszerrel, lényegesen jobb hatásfokkal nyerhető ki a szokásos ioncserélős módszerekkel (pl. a 3 091 572 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, vagy a 167 121 lsz. magyar szabadalmi leírás) előállított nyers antibiotikum elegyből kiindulva, ha az elválasztást szilikagél kromatográfia helyett különféle karboxil-típusú kationcserélő gyantákon (Amberlite CG—50—II, III, Amberlite IRP—64) vagy savas csoportokat tartalmazó dextrán-géleken (CM, illetve SP Sephadex) végezzük híg vizes ammóniumhidroxid-oldatok segítségével szelektív leoldással. A találmány szerint úgy állítjuk elő gentamicin antibiotikumokat, hogy a Micromonospora purpurea var. nigrescens nov. var. X—148 jelzésű sugárgomba törzset komplex fehérjét, szénhidrátot, ásványi sókat és biosz anyagokat tartalmazó — táptalajon aerob körülmények között 22—45 C°-on, előnyösen 28—33 C°-on tenyésztjük, majd a keletkezett antibiotikumokat a fermentléből elkülönítjük és az elkülönített antibiotikum elegyet komponenseire szétválasztjuk. A találmány szerinti eljárás egy előnyös kivitelezési módja a gentamicin-A, -B, -Bj, -C, ^X és sziszomicin szétválasztását savas jellegű, célszerűen karboxil-típusú kationcserélő gyantákon és/vagy karboximetil- vagy szulfonsav-csoportokat tartalmazó dextrán-gélen történő kromatográfiával végezzük illékony ammóniumbázisok híg vizes oldataival, szelektív leoldás segítségével. A találmány értelmében a gentamicin-A, -B, -Bj, -C, -X és sziszomicin szétválasztását célszerűen úgy végezzük, hogy a Micromonospora purpurea var. nigrescens erjesztéses oldatából ismert módon kapott antibiotikum elegyet vagy bármely gentamicin-A-t, -B-t, -B[-t, -X-t, ill. sziszomicint vagy ezek bármelyikét, ill. más anyagokat is tartalmazó elegyet, melyet mikrobiológiai úton vagy bármely más úton kapunk, első lépésben karboxil-típusú kationcserélő gyantán (ammónium-forma) kötjük meg, majd fokozatosan növekvő koncentrációjú (0,05—0,18 n) vizes ammóniumhidroxid-oldatokkal gradiens leoldást végzünk. Megfelelő számú frakció szedése után, megfelelő leoldási sebesség, ill. gyantamennyiség esetén a gentamicin-A, -B, -B^ -X és sziszomicin elkülönülve oldódik le az ioncserélő gyantaoszlopról. A gentamicin-C leoldása érdekében a leoldást töményebb, 0,18—0,30 n ammóniumhidroxid-oldatokkal folytatjuk. Papír- illetve rétegkromatográfiás ellenőrzés után a gentamicin-A, -B, -Bi, -X és sziszomicin antibiotikumokat tartalmazó frakciókat egyesítjük, majd vákuumban szárazra pároljuk. Az így kapott anyagok csekély mennyiségben még szennyezve lehetnek egymással vagy kis mennyiségű egyéb kísérő anyagokkal, és így célszerű azokat a végső tisztítás érdekében egy újabb ioncserélő gyantán vagy dextrán-gélen végzett kromatográfiának alávetni. Ezt a következő tisztítási lépést célszerű karboximetil- vagy szulfonsav-csoportokat tartalmazó dextrán-gélen (CM-Sephadex C—25 — SP—25) vizes ammóniás gradiens elúciós kromatográfiával vagy valamely erősen bázisos anioncserélő gyantán, pl. Dowex—1X2 gyantán ionmentes víz segítségével végzett szelektív leoldással vagy egy másik finomszemcsés kar-5 boxil-típusú kationcserélő gyantán megismételt újabb kromatográfiával végezni. A fenti kromatográfiás elválasztási lépések célszerű kombinálásával valamennyi antibiotikum esetében két kromatográfiás elválasztási lépés után teljesen tiszta hatóanyagot kapunk igen jó, 10 50—60%-os hozammal. Az eljárás jelentős előnyökkel rendelkezik a korábbi, gentamicinek előállítására ismertetett eljárásokkal szemben. A nagyüzemi termelésben alkalmazott táptalaf összetétele igen egyszerű és olcsó, csupán szójalisztet, 15 glicerint, burgonyakeményítőt, kalciumkloridot, kobaltkloridot és habgátlóként pálmaolajat tartalmaz. Az elért gentamicin-C termelési szint laboratóriumi körülmények között eléri az lOOOpig/ml-es szintet, nagyüzemi 20 m3 -es fermentorokban pedig a 700—900 |i.g/ml-t, 20 amely kétszerese a 3 136 704 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, és közel 1,2-szerese a 772 789 sz. belga szabadalmi leírásban ismertetett, csak laboratóriumi (4 literes) szinten, illetve szintén kétszerese az itt ismertetett félüzemi (260 liter) méretben elért 25 termelésnek. A találmány szerinti eljárás gentamicin-A, -B, -B[, -X és sziszomicin elkülönítésére vonatkozó részének igen nagy előnye, hogy elkerüli a tűzveszélyes (metanol), 30 illetve mérgező (kloroform) anyagokat, és a speciális szerkezeti anyagokat (teflon) igénylő szilikagél-kromatográfiás lépést. Az eljárás során végig vizes oldatokkal dolgozunk. Az egyes gentamicin-komponensek nagy hő-, sav- és alkáli-stabilitása következtében pedig az 35 egyszerű vákuum-bepárlás így teljesen tiszta, ionmentes víz alkalmazása esetén teljesen hamumentes, nagytisztaságú termékeket eredményez. Az eljárás további igen nagy előnye, hogy a gentamicin-C-t kísérő antibiotikumok (gentamicin-A, -B, -B^ -X, sziszomicin) előállítását 40 a gentamicin-C tisztításával egyidejűleg oldja meg, és így ezek a szintén értékes tulajdonságokkal rendelkező antibiotikumok a kiemelkedő gyógyászati jelentőségű gentamicin-C tisztításának hasznos melléktermékeként kaphatók meg. 45 Az eljárás igen egyszerű; nincs szükség a teljes antibiotikum komplex Amberlite IRA—401S gyantán történő előzetes színtelenítésére, sem a gentamicin-C és az egyéb antibiotikumok Dowex—1X2 gyantával történő 50 előzetes részleges elválasztására, sem pedig a gentamicin-A karbonát sójának előzetes elkülönítésére, hanem a szokásos úton a kapott nyers antibiotikum komplexből igen egyszerű módon egy lépésben oldja meg valamennyi antibiotikum elválasztását, mégpedig igen jó, az ismert 55 eljárások hatásfokát messze felülmúló hozammal. Az eljárás további előnye, hogy az így előállított gentamicin-típusú antibiotikumok közül egyes anyagok esetében, melyeket a későbbiekben részletesen ismertetünk, 60 meglepő új és igen jelentős kemoterápiás hatásokat ismertünk fel. Az eljárásunkkal előállított gentamicin-A, -B, -B,, -C, -X és sziszomicin antibiotikumok fizikai állandóit az 65 alábbi táblázat tartalmazza: 5
