168735. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gamma-glutamil-p-nitroanilid-szárm előállítására és gamma-glutamiltranszpeptidaz aktivitásának meghatározására
5 168735 6 szulfoniloxicsoport, reagáltatunk és a képződött glutaminsav-p-nitroanilid-származék védőcsoportját előnyösen hidrazinnal lehasítjuk. A kapott vegyületet kívánt esetben sóvá alakítjuk át. A glutaminsav-anhidridet például úgy állítjuk elő, hogy a glutaminsavat egy védőcsoport bevitele után ecetsavanhidriddel reagáltatjuk; így a megfelelő glutaminsav-anhidridet kapjuk. A glutaminsav-anhidrid helyett egy glutaminsav-halogenidet, vagy valamely más glutaminsav-származékot is használhatunk, amely a glutaminsav karboxilcsoportja és az anilin aminocsoportja közötti savamidkötés létesítésének megkönnyítésére alkalmas. Ilyen megfelelő aktivált származékok a peptidkémiából ismertek. A fltaloilglutaminsav-anhidridet célszerűen szerves oldószerben, adott esetben valamely amin jelenlétében reagáltatjuk. Szerves oldószerként előnyösen dioxánt használunk, azonban más oldószert is használhatunk, például tetrahidrofuránt, formamidot, dimetilformamidot és hasonlókat. Aminként előnyösen valamely alifás tercier amint használunk, különösen olyat, amely alkilcsoportonként 1—6 szénatomot tartalmaz. A hidrazinnal történő reakciót célszerűen valamely rövidszénláncú alkohol, mint oldószer jelenlétében hajtjuk végre. A nyerstermékeket szokásos módszerekkel, például átkristályosítással vagy kromatografálással, — így ioncserélő gyantával töltött oszlopon és/vagy adszorpciós kromatográfiával — tisztíthatjuk adszorbeálószerként kovasavgélt, alumíniumhidroxidot és hasonlókat használva, amelyek különösen alkalmasak vékonyrétegkromatográfiás célokra. Az atnmóniumsókat vizes-acetonos elegyből végzett átkristályosítással is tisztíthatjuk. A találmány szerinti előnyös vegyületek oldékonysága már oldásközvetítő anyag nélkül is 120 mmól fölött van, vagyis legalább 40-szer nagyobb, mint a y-glutamil-p-nitroanilid oldékonysága. A következő példák közelebbről is megvilágítják a találmány szerinti vegyületek előállítását, ezek tulajdonságait és szubsztrátként való alkalmazásukat a y-glutamiltranszpeptidáz (y-GT) meghatározásnál. A találmány szerinti vegyületnek nemcsak az oldékonysága jobb mint a y-glutamil-p-nitroanilidé, hanem az oldásnál sem igényelnek melegítést, ily módon a nagyobb vak-extinkció-értékeket elkerülhetjük. A vegyületek stabilitása oldatban jó, a y-GT meghatározására szolgáló vizsgálati körülmények optimalizálásánál nem jelentkeznek problémák, ami a klinikai kémiai kívánalmai szempontjából nagy jelentőségű. A vegyületek előállítása egyszerű és olcsó, a mérőberendezés érzékenysége olyan, mint a y-glutamil-p-nítroanilid használata esetén. 1. példa 5-(y-glutamiI-amino)-2-nitro-benzoesav (GLUPA-3-karbonsav) előállítása 9,1 g 2-nitro-5-amino-benzoesavat (50 mmól) és 14,2 g ftaloil-glutaminsav-anhidridet ((55 mmól) 13 ml tributilamin hozzáadása után 50 ml abszolút dioxánban oldunk. A reakciókeveréket 2 órán keresztül visszafolyató hűtő alkalmazása mellett forraljuk. Lehűlés után a reakciókeveréket 100 ml 2 n ammóniumhidroxidoldattal elegyítjük és a kiváló tributilamint éterrel kirázzuk. A vizes oldatot szárazra pároljuk, metanolban oldjuk és 80%-os hidrazinhidráttal a pH-értékét 10-re állítjuk. A reakcióoldatot körülbelül 20 órán keresztül 5 szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Ennek során részben kiválik egy termék, amelyet kiszűrünk és metanolos mosás után eldobunk. A metanolos oldatokat szárazra pároljuk és az olajos maradékot körülbelül 300 ml desztillált vízben oldjuk. 10 A fenti vizes oldatot 100 ml Dowex 1 X2-veI töltött (50—100 mehs, forrmat alak) oszlopon kromatografáljuk, 300 ml desztillált vízzel mossuk és graduálva 2 liter vízzel 2 liter 0,5 n ammóniumkarbonát-oldattal szemben eluáljuk. Az eluátumot 100 ml-es frakcióként 15 szedjük és vékonyrétegkromatográfiával (Fa. Riedel de Haen, Nr. 37350 minőségű kovasavgél lapokon) butanol: jégecet: víz = 50: 15:15 arányú elegyében vizsgáljuk (a kromatogramok előhívása: ultraibolya fényben kék foltok, vagy ninhidrinnel lefújva és ezután me-20 legítve, az aminosavtartalmú zónákban barna foltok). Az 5-(y-glutamil-amino)-2-nitro-benzoesav-monoammóniumsó tartalmú frakciókat (Rf érték = 0,25) együttesen vákuumban szárazra pároljuk. A visszamaradó port abszolút alkohollal elkeverjük, leszűrjük és vá-25 kuumban kalciumklorid felett szárítjuk. Kitermelés: 7 g 5-(y-glutamil-amino)-2-nitro-benzoesav-monoammóniumsó (az elméleti érték 58%-a). ultraibolya-spektrum: Xmax =317 nm. e = 11,7 (cm2 /u,mól) 317 nm-nél 30 2. példa A y-GT meghatározása GLUPA-3-karbonsavval 35 Az enzimatikus hasításnál 2-nitro-5-amino-benzoesav válik szabaddá. E vegyület ultraibolya-spektrumának jellemzői a következők: >W = 3 80nm 40 s = 9,4 (cm2 /f/.mól) 504 nm-nél s = 12,75 (cm2 /[xmól) 308 nm-nél c = 9,83 X10~5 mól A) A mérés elvégzése: 45 Oldatok: 0,1 mólos trisz-pufferoldat (mely glicilglicinre is 0,1 mólos) 1,21 g trisz-pufferanyagot [trisz(hidromixetil)-amino-metánklorid] és 1,32 g glicilglicint 90 ml kétszer desztillált vízben oldunk és 1 n sósav-oldattal 8,25 50 pH-értékre állítjuk be, majd kétszer desztillált vízzel feltöltjük 100 ml-re. Szubsztrát-oldat: 4,5 g GLUPA-3-karbonsavat (monoammóniumsóként 1 molekula kristályvízzel számítva) feloldunk az említett trisz-pufferoldat 100 ml-ében. 55 2,8 ml 0,1 mólos trisz-pufferoldatot és 0,2 ml szubsztrát-oldatot küvettába pipettázunk, az oldatokat 25 C°ra temperáljuk, majd kezdjük a vizsgálatokat 0,2 ml humánszérum hozzáadásával. Összekeverés után leolvassuk az extinkciót 405-nm-nél, egyidejűleg megin-60 dítjuk a stopperórát. Pontosan 1, 2 és 3 perc múlva megismételjük az extinkció leolvasását. A vizsgálatnál a végkoncentrációk a következők: Trisz/HCl= 93,8 mmól GLUPA-3-karboxilát =8,1 mmól 65 Glicilglicin = 93,8 mmól 3
