168434. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a módosított szerkezetű emberi adrenokortikotróp hormon és fragmensei előállítására
3 168434 4 (1967); Kisfaludy L. és munkatársai: J. Org. Chem. 35, 3563 (1970); Kovács J. és munkatársai: J. Am. Chem. Soc. 89, 183 (1967)], azonban ezek tapasztalatai alapján [Shibnev V. A., Csuvajeva T. T.: Izv. Akad. Nauk SSSR, Ser. Khim. 1967(4), 954] ez a módszer az ismert és legalkalmasabbnak tartott egyéb aktívészteres eljárásokhoz képest nem tűnt előnyösnek nagyobb tagszámú peptidek előállítására. Vizsgálataink szerint az adrenokortikotrop hormon és fragmensei szintéziséhez a pentafluorfenolos módszer igen előnyösen felhasználható, és a továbbiakban részletesen ismertetett, nem várt előnyökkel rendelkezik. Találmányunk tehát új eljárás az (I) általános képletű, emberi adrenokortikotrop hormon és fajspecifikus fragmensei H-Ser-Tvr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val- (I) Lys-Val-Tyr-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu-Asp-Glu-Q — ebben a képletben Q az alábbi jelentésű lehet a) Ser-OH b) Ser-Ala-OH c) Ser-Ala-Glu-OH d) Ser-Ala-Glu-Ala-OH e) Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-OH 0 Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-OH g) Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-OH h)Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-OH i) Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe-OH — valamint ezek védett származékainak és/vagy savaddíciós sóinak előállítására a megfelelő védett peptidfragmensek aktivészteres módszerrel történő kapcsolása, kívánt esetben a védőcsoportok ezt követő iehasítása és kívánt esetben szervetlen vagy szerves savval való sóképzés útján, amelynek lényege, hogy a védett peptidekkel lefolytatott kapcsolási reakcióban az acilező komponens karboxilcsoportját pentafluorfenilészterré alakítva aktiváljuk, majd az acüezési reakciót 0 és 25 °C között végezzük. A kiindulási és közti termékeket az ismert peptidkémiai módszerekkel állíthatjuk elő. Aminocsoportok védésére például benzil-oxi-karbonil-, terc-butiloxikarbonil-, p-klór-benziloxi-karbonil-csoportot, a karboxilcsoportok védelmére észterezést, elsősorban metanolt, etanolt, terc-butanolt alkalmazhatunk. Az oldalláncok hidroxilcsoportjait szükség esetén éterezéssel védhetjük és ehhez például terc-butanolt vagy benzilalkoholt használhatunk. Az arginin guanidinocsoportjának megvédésére elsősorban nitrocsoport alkalmas, de a guanidinocsoportot protonált formában is használhatjuk. A védőcsoportok megfelelő kombinációjával elérhető, hogy ezek a szintézis során hidrogenolízissel, illetve acidolízissel szelektíven, illetve a szintézis végén egyszerre eltávolíthatók legyenek. A kisebb tagszámú peptidek előállítása történhet például lépésenkénti módszerrel vagy fragmens kondenzációval, és ehhez a szokásos vegyes-anhidrides, azidos, aktív észteres, diciklohexil-karbodiimides módszert használhatjuk. A védett közti termékek kapcsolásához felhasznált acilező komponens karboxilcsoportját körülbelül 0 °C és szobahőmérséklet között alakíthatjuk pentafluor-fenilészterré, célszerű a 0 °C körüli hőmérséklet. Az acilezés történhet úgy, hogy a pentafluorfenilésztert kipreparáljuk, de eljárhatunk úgy is, hogy közvetlenül a reakciókeverékben állítjuk elő, például pentafluorfenol és diciklohexil-karbodiimid hozzáadá-5 sával. Előnyösnek bizonyult, ha előzőleg pentafluorfenolból és diciklohexil-karbodiimidből komplexet állítunk elő [J. Am. Chem. Soc. 89, 183-184 (1967)], és ezt adjuk a reakciókeverékhez mintegy 1,2-1,5 mólnyi mennyiségben, mivel a komplex 10 készítésekor a diciklohexil-karbodiimid esetleges kéntartalmú szennyeződései eltávolíthatók, amelyek a kapcsolást rendszerint követő hidrogénezést károsan befolyásolhatják. A pentafluor-fenilészterekkel végzett acilezés során 15 nincs szükség fölös bázis, tehát vagy az aminkomponens, vagy külön tercier bázis, például N-trietil-amin feleslegére a szabaddá való pentafluorfenol megkötéséhez. Egyes aktív észteres, például pentaklórfenolos módszer alkalmazása esetén ugyanis a kapcsoláskor 20 egyensúly áll be, mely csak bázis felesleggel tolható el kívánt irányba. Ennek az a magyarázata, hogy bár irodalmi adatok szerint a két fenolszármazék pK -értéke azonos (PK= 5,3), és azt tapasztaltuk, hogy a két fenol dimetil-formamidban - mely na-25 gyobb tagszámú peptidek leggyakoribb oldószere -mért pK -értéke'jelentősen eltér, a pentaklórfenolé 5,05, míg a pentafluorfenolé 6,35. Ez tehát azt jelenti, hogy az utóbbi dimetil-formamidban kevésbé disszociált formában van, így a bázis protonálása, és 30 így a kapcsolási reakció lefékeződése elmarad. A reakció során felszabaduló pentafluorfenol a reakciókeverékből teljesen és könnyen például éterbe öntéssel eltávolítható. Pentaklórfenol, illetve szerves bázisokkal alkotott sói használata esetén a reakció-35 keverékben visszamaradó bármilyen kis mennyiségből a kapcsolást követő katalitikus hidrogénezéskor sósav keletkezik, mely a savérzékeny védőcsoportokat károsítja. Előnyös továbbá az is, hogy a pentafluor-fenilészterek szerves oldószerekben rendkívül oldékonyak, 40 ezért az oldószer-felhasználás esetenként jelentősen csökkenthető. A legújabb irodalmi adatok szerint nagyobb tagszámú peptidek előállításánál a jobb kitermelés és tisztább termék elérése érdekében magasabb 45 tiőmérsékleten dolgoznak és/vagy az acilező komponenst feleslegben alkalmazzák. [Schwyzer R., Schiller ?. W., Helv. Chim. Acta, 54, 897 (1971); Wünsch E., Ber. 104, 2445 (1971)]. A találmányunk szerinti pentafluorfenolos módszer használata esetén nem 50szükséges magasabb hőmérsékleten és az acilező komponens feleslegével dolgozni. Például, ha a Z-Lys(BOC)-Arg(N02 )-Arg(N0 2 )-Pro-Val- Lys(BOC> Val-Tyr(tBu)-Pro-OH védett dekapeptidet a H-Asn-Gly-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-(OtBu) hep-55tapeptiddel vagy a H-Asn-Gly-Alä-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser-Ala-OtBu oktapeptiddel ekvivalens mennyiségben dimetil-formamidos oldatban pentafluorfenol és diciklohexil-karbodiimid komplexével szobahőmérsékleten reagáltatjuk, akkor a 60 vékonyréteg kromatográfiás vizsgálatok szerint a reakció 5-6 óra alatt lejátszódik, és a védett heptadekapeptidet (15—31), illetve oktadekapeptidet (15—32) egyszerű módon feldolgozva 80% feletti kitermeléssel kapjuk. Hasonló jó kitermelés érhető el, ha a 155 880 65 számú magyar szabadalmi leírásban ismertetett védett 2
