168378. lajstromszámú szabadalom • Eljárás orgotein kromotográfiás elkülönítésére egy lépésben
168378 19 20 fugálunk, elroncsolunk és dializálunk a 4. példában ismert módon. A dializált extraktumot a 4. példában ismertetett módon kiegyensúlyozott DEAE-cellulózzal töltött, 2,5 cm X 38 cm méretű (üres térfogata 186,2 ml) oszlopra visszük fel. Az oszlopot először a 4. példában ismertetett módon kezeljük. Az orgoteint az ott említett 0,005 mólos foszfát-puffer 6 literjével eluáljuk, a puffer ionerősségét nátrium-klorid adagolása útján közben 0-ról 0,10 mólra emeljük. Az eluátum réz- és cinktartalmát, valamint az A265 és az A280 abszorpciót a korábban ismertetett módon mérjük. Az orgotein ott eluálódik, ahol az első csúcs megjelenik közel 1 vagy egynél nagyobb A265/A 280 aránnyal, valamint maximális réz- és cinktartalommal. Az orgoteint tartalmazó frakció tehát 0,05—0,06 mól nátrium-klorid gradiens esetén eluálódik (150-170. mintavevő csövecskék, össztérfogat mintegy 200 ml), és tartalmazza a nagy tisztaságú orgotein túlnyomó részét. Az orgoteint tartalmazó frakciót ionmentes vízzel szemben addig dializáljuk, míg vezetőképessége mintegy 0,3—0,45 u mho nem lesz, majd 0,45 mikronos szűrőn szűrjük és liofilizáljuk. Mintegy 60 mg orgoteint kapunk (0,0125%, az ép vörös vírsejtekre számítva). Hasonló eredményeket kapunk, ha az oszlopot mintegy 0,015 mól koncentáricóban nátrium-kloridot tartalmazó 0,005 mólos foszfát-pufferrel kezeljük az orgoteinnél könnyebben deszorbeálódó fehérjék eluálására, majd 0,03 mól nátrium-kloridot tartalmazó puffert használunk az orgotein eluálására, és végül az oszlop regenerálásra mintegy 0,1 mól nátrium-kloridot tartalmazó puffert használunk, azaz az eluálást nem folyamatosan hanem ugrásszerűen növekvő ionerősségű eluálószerrel végezzük. 7. példa A példában 1100 ml 3,8% nátrium-citrátot tartalmazó vizes oldattal 0,5 v/v arányban kezelt friss nyúlvért használunk. A nyúlvért a 4. példában ismertetett módon centrifugáljuk, elroncsoljuk és dializáljuk (térfogatnövekedés: mintegy 100%). A dializált extraktumot a 4. példában ismertetett DEAE-cellulózzal töltött, 2,5 cm X 41 cm méretű (üres térfogata 201 ml) oszlopra visszük fel. Az oszlopot először az ott ismertetett módon kezeljük. A hemoglobin legnagyobb része távozik az átöblítési térfogatban, míg az oszlopban maradt hemoglobin további 500 ml pufferrel eltávolítható (összesen 650 ml). Az orgoteint 0-ról 0,08 mólra növekvő koncentrációban nátrium-kloridot tartalmazó 0,005 mólos foszfát-pufferrel eluáljuk. Az eluátum réz- és cinktartalmát, valamint az A265 és az A 280 abszorpciókat a korábban ismertetett módon mérjük. Az orgotein az első csúccsal jelentkezik, ahol az A265 /A 28 o arány közel 1 vagy I-nél nagyobb, míg a réz- és a cinktartalom maximális. 0,020—0,030 mól nátrium-klorid gradienssel eluált frakció (60-90. mintavevő csövecskék, össztérfogatuk mintegy 240 ml) tartalmazza a nagy tisztaságú orgotein túlnyomó részét. Az orgoteint tartalmazó frakciót ionmentes vízzel szemben addig dializáljuk, míg vezetőképessége mintegy 0,3-0,45 (i mho nem lesz, majd 0,45 mikronos szűrőn szűrjük és liofilizáljuk. Mintegy 45 mg orgoteint kapunk (0,01%, az ép vörös vérsejtekre számolva). További mennyiségű, de kisebb tisztaságú orgoteint tartalmaznak az eluátum szomszédos frakciói. Hasonló eredményeket kapunk, ha az oszlopot mintegy 0,015 mól koncentrációban nátrium-kloridot tartalmazó 0,005 mólos foszfát-pufferrel kezeljük az orgoteinnél könnyebben deszorbeálódó fehérjék eluálására, majd 0,02 mól nátrium-kloridot tartalmazó pufferrel eluáljuk az orgoteint, végül az oszlop regenerálására 0,1 mól nátrium-kloridot tartalmazó puffert használunk, azaz az eluálást nem folyamatosan, hanem ugrásszerűen növekvő ionerősségű eluálószerrel végezzük. Utólag tisztított orgotein Az előző példákban ismertetett módon előállított orgotein tovább tisztítható molekulaszűrős gázkromatográfia útján Sephadex G-75 Superfine márkanevű (gyártó cég: Pharmacia, Svédország), epiklórhidrinnel térhálósított dextrán gyantával töltött 3,2 cm X 88,5 cm méretű (üres térfogat 711,5 ml; átöblítési térfogat 265,5 ml) oszlopot használva, az eluátumot 5,4 ml-es frakciókba gyűjtve, valamint az A265 és az A 280 abszorpciókat mérve. Az 50. frakciótól kezdve ezek az abszorpciók meredeken emelkednek, és a 68. frakciónál elérik a csúcsot. A 66—73. frakciók tartalmazzák az igen tiszta orgotein nagyobb részét. A 98. frakciónál az abszorpciók visszaesnek 0 értékre mintegy a 116. frakcióig. Az egyetlen jelentős szennyeződés a 118-150. frakciókban jelenik meg. A 4. példában ismertetett módon kapott orgotein tisztítható utólagosan karboximetil-cellulózzal (CMC) töltött oszlopon is. Elkészítünk egy 11 ml-es CMC-oszlopot, és 5,3 pH-értékű, 0,01 mólos nátriumacetát-oldattal kiegyensúlyozzuk. A DEAE-cellulózzal tisztított orgoteinből 40 mg-ot feloldunk 5,3 pH-értékű, 0,01 mólos acetát-pufferben, majd ugyanezen pufferrel szemben (több adagot alkalmazva a pufferből) dializáljuk. Adott esetben az oldhatatlan anyagokat centrifugálás útján elkülönítjük, és a tiszta felülúszó fázist a CMC-oszlop tetejére rétegezzük. Az átfolyási sebesség mintegy 12 ml/óra. Az oszlopot 30 ml 5,3 pH-értékű 0,01 mólos acetát-pufferreljnossuk a nem adszorbeálódott fehérjék eluálására. Az eluálást ezután 0,01 mól-ról 0,1 mólra lineárisan növekvő koncentrációjú, 5,3 pH-értékű nátrium-acetáttal folytatjuk, összesen 200 ml térfogatban. Igen tiszta orgotein eluálódik 0,018 mól és 0,028 mól között. Az így kapott frakcióból az orgoteint a fentiekben ismertetett módon elkülönítjük. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás orgotein kromatográfiás elkülönítésére egy lépésben állati vagy emberi szövetekből vagy vörös vérsejtekből az orgotein és más, pufferekben oldható fehérjék elegyének kromatográfiás elkülönítése útján, ahol a fehérjék elegyét vízzel vagy 7-9, előnyösen 7,5-7,8 pH-jú pufferrel készült, 0,01 mólnál kisebb ionerősségű vizes oldatban gyengén bázikus csoportokat tartalmazó ioncserélő gyantából álló oszlopra felvisszük, a gyantán az orgoteint és az elegy fehérjéinek egy részét adszorbeáljuk, a gyantáról az adszorbeálódott fehérjéket a felvitelhez használt 10
