168378. lajstromszámú szabadalom • Eljárás orgotein kromotográfiás elkülönítésére egy lépésben
168378 9 10 lényegében tiszta orgoteint tartalmazó eluátum-frakciót kapjunk. Ennek elérésere az adszorbeálódott fehérjéket az oszlopból fokozatosan eluáljuk, és mérjük az eluátum kétvegyértékű fémtartalmát, valamint előnyösen az eluátum A265 és/vagy A 280 abszorpcióját. Mint azt már korábban említettük, döntő, hogy a használt ionerősségek esetén az eluálószer pH-értéke mintegy 6 legyen. Más pH-értéken más fehérjék eluálódnak az orgoteinnel egyidejűleg olyan mennyiségekben, melyek eredményeképpen lényegében tiszta orgotein helyett nagy mértékben szennyezett terméket kapunk. A gyantáról az adszorbeált fehérjék egymást követő eluálására ismert módszer olyan puffer használata, melynek ionerőssége fokozatosan nő mintegy 0,01 mól alatti értékről mintegy 0,03 mól értékre. DEAE-cellulóz esetén a nem kívánt fehérjék legnagyobb részét olyan eluálószerrel eluáljuk, melynek ionerőssége kisebb, mint 0,02 mól. Az orgoteint olyan pufferrel eluáljuk, melynek ionerőssége mintegy 0,02-0,03 mól, míg a még az oszlopban maradt egyéb fehérjéket olyan eluálószerrel eluáljuk, melynek ionerőssége a pufferénél nagyobb. Általában a végső ionerősség legalább mintegy 0,1 mól és legfeljebb mintegy 2 mól, miáltal az oszlop megtisztul, és így regenerálódik újbóli fehasználásra. A folyamatosan növekvő ionerősség-gradiens helyett lépcsőzetes gradiens is használható az eluálás során, azaz mintegy 0,001—0,005 mólos puffer a könnyen eluálható szennyező fehérjék eluálására, mintegy 0,02—0,03 mólos puffer az orgotein eluálására, és mintegy 0,1—2,0 mólos puffer az oszlop megtisztítására az adszorbeálva maradt szennyező fehérjéktől. Függetlenül attól, hogy a gyantát folyamatosan vagy ugrásszerűen növekvő ionerősségű pufferrel eluáljuk, nagy tisztaságú orgotein előállítása szempontjából igen fontos, hogy a frakciót helyesen válasszuk meg. Ez annyit jelent, hogy bizonyos mértékben az összesített termelési hányad és a végső tisztaság között egyensúlyt kell találni. Ha azonban a frakciót pontosan az optimális helyen vesszük le, az esetben lényegében tiszta orgoteint magas termelési hányaddal kapunk. A találmány szerinti eljárás egyik döntő tényezője tehát annak a pontnak a pontos és helyes megválasztása, ahol az orgotein-frakciót elvesszük. Az eluátum lényegében tiszta orgoteint tartalmazó frakciójának elhelyezkedése meghatározható a kétvegyértékű fémtartalom és előnyösen az eluátum 280 mm-en 265 nm-en mérhető abszorpciója közül legalább az egyik abszorpció folyamatos vagy meghatározottan ismétlődő periódusokban végzett mérése útján. Minthogy az eluátum rendszerint egyébként nem tartalmaz jelentős mennyiségben kétvegyértékű fémiont, az orgotein eluálása detektálható azáltal, hogy az eluátumban jelentősen megnő a kétvegyértékű fémtartalom. Minthogy az orgotein rendszerint természetes állapotban nem más, mint egy vegyes réz-cinkkelát, a réztartalom vagy előnyösen mind a réz-, mind a cinktartalom mérése útján az eluátumban az orgotein megjelenése igen pontosan meghatározható. Igen nagy tisztaságú orgoteint tartalmazó frakció elkülönítésére az eluátum A28 o és A 265 abszorpcióját is mérjük. A jelentős mennyiségű cinket vagy rezet tartalmazó eluátum-frakción belül az orgoteint tartalmazó frakció ott kezdődik - ha kiindulási anyagként állati szövetekből elkülönített oldható fehérjéket használunk —, ahol a rézr és cinktartalom növekedése 5 együtt jár a 265 nm-nél és 280-nm-nél mérhető abszorpció csökkenésével. A frakció végét jelzi a réz- és cinktartalom éles visszaesése, valamint a 265-nm-nél és 280 nm-nél mérhető abszorpció éles megnövekedése. Csak az egyik fémtartalom, valamint 10 az egyik hullámhosszon mérhető abszorpció figyelése is elegendő az említett pontok meghatározásához. Előnyösen azonban mind a négy értéket meghatározzuk. Ha mind a 280 nm-nél, mind a 265 nm-nél mérhető abszorpciót észleljük, úgy az orgoteint tartal-15 mázó frakció kezdete meghatározható az A2 65 /A2R0 aránnyal, azaz az orgoteint tartalmazó frakciót ott vesszük el, ahol ez az arány maximális, illetve közeli vagy nagyobb mint a maximum. Az orgoteint tartalmazó frakció elkülönítését ott fejezzük be, ahol az 20 A2 6s/A 2 8o arány ugrásszerűen lecsökken, jelezve az orgoteintől idegen fehérjetartalom megnövekedését az eluátumban. Vörös vérsejtekből elkülönített oldható fehérjék esetén — amikor is az elutátum jelentős mennyiségű 25 rezet és cinket tartalmaz — az orgoteint tartalmazó frakció elkülönítését azon a ponton kezdjük meg, amikor az A265 /A 28u arány eléri a maximumot, illetve közel van vagy nagyobb a maximumnál. Az . orgotein-frakció végét jelzi, ha a réz- és cinktartalom 30 csökken, valamint az A265 /A 2 so arány esik, jelezve az orgoteintől idegen fehérjetartalom növekedését az eluátumban. A kétvegyértékű fémtartalom pillanatszerű meghatározására szolgáló ismert módszer az atomabszorp-35 ciós spektrofotometria. Réz és cink egyidejű mérésére alkalmas berendezés az Instrument Laboratories, Inc. (Lexigton, Massachusetts, Amerikai Egyesült Államok) cég által gyártott „Model 353" nevű berendezés. 40 Az A2 6s és A 280 abszorpciók meghatározhatók folyamatosan vagy megszakításokkal ismert módon, míg arányuk meghatározható közvetlenül differenciál-spektrofotométerrel. Ioncserélő kromatográfia során az eluátum réz és 45 cinktartalmának, valamint az A2 65 és A 2 go abszorpcióknak grafikusan ábrázolt görbéje - mint azt a 2. példában később ismertetjük, az eluátum minden aliquotját mérve — megmutatja, hogy a réz- és cinktartalom meredeken nő, ha az eluátum molaritása 50 eléri a mintegy 0,018 mól értéket. A mintegy 0,022-0,025 mólnál jelentkező csúcs elérése után a fémtartalom meredeken csökken. Az A26s és A 2g0 abszorpciók 0,022 mólkoncentráció esetén az orgoteintől idegen fehérjék jelentős növekedését mutatják, 55 egyidejűleg az A2 g 5 /A 2 8o arány csökken. Ezt követi az abszorpció fokozatos növekedése mintegy 0,04 mólkoncentrációig. A 4. példában ismertetett ioncserélő kromatográfia során kapott eluátum réz- és cintartalmának, valamint az A2 6s éa A 2 go abszorp-60 cióknak megfelelő grafikusan ábrázolt görbék -melyek az eluátum minden aliquotjának méréséből adódnak - megmutatják, hogy a réz- és cinktartalom meredeken nő, míg az eluátum molaritása a mintegy 0,02 mól értéket el nem éri. Mintegy 0,02 mól esetén 65 jelentkező csúcs után a fémtartalom meredeken.
