168354. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és próbapapir testfolyadék egy komponensének kromogén vegyületek oxidációján alapuló meghatározásra

3 168354 4 Az oxidálószerrel kezelt anyagot használhatjuk külön, a próbapapírral kombinálva vagy próbapapírként. Ha az oxidálószerrel kezelt anyagot a próbapapírra felvisszük vagy a próbapapírba bevisszük, akkor különösen jól használható reakciórendszerek, 5 pl. egy peroxidból, peroxidázból és egy oxidálható kromogén vegyületből álló reakciórendszer vagy egy hidrogén-peroxidra bomló oxidoreduktázból, annak egy megfelelő szubsztrátjából, egy peroxidázból és egy oxidálható kromogén vegyületből álló reakció- 10 rendszer egy komponensének meghatározására. Az oxidálószerrel kezelt anyag mellett a próbapapír a reakciórendszer valamennyi komponensét tartalmazza, kivéve természetesen a meghatározó komponenst. A próbapapír ezen felül egy vagy több 15 segédanyagot, pl. pufferanyagot tartalmazhat. A reakciórendszer komponenseit használhatjuk szabad vegyületek alakjában vagy egy megfelelő hordozóhoz kötve. A hordozóhoz között vegyületeket különféle módon, pl. adszorpcióval vagy kovalens 20 kötéssel való rögzítéssel kaphatjuk. Az utóbbi megoldás előnyösebb, mert így az illető komponenst nem lehet olyan könnyen leöblíteni a próbapapírról a meghatározás közben, azon felül ily módon lehetővé válik a vivőanyag megnnyiségének közvetett meghatá- 25 rozása. így pl. a peroxidáz meghatározására használt próbapapír tartalmazhat fosztfátpufferhez kötött hidrogén-peroxidot, míg magát a peroxidázt ugyancsak egy megfelelő hordozóhoz, pl. emberi eredetű chorion gonadotropinhoz (HCG) köthetjük. Az utóbbi eset- 30 ben a peroxidáz mennyisége egyúttal a HCG mennyiségét is jelzi. A találmányt az alábbi példákkal világítjuk meg közelebbről az oltalmi kör korlátozása nélkül. 35 1. példa 20X4 cm-es Schleicher—Schüll 2316 szűrőpapírcsíkokat 4 g perjódsav 600 ml vízzel készített oldatában áztatunk 16 órán át. (Célszerűen egy éjszakán át állni hagyjuk.) Ezután a csíkokat vízzel 40 mossuk mindaddig, míg perjódsavra negatív reakciót kapunk, azután megszárítjuk. 2. példa 20X5 cm méretű, négyzetméterenként 83—87 g 45 súlyú S & S 589/3 szűrőpapírcsíkokat három órán át tartunk egy 300 ml 0,1 n kálium-permanganátból, és 30 ml 4 n kénsavból álló oldatban. Ezután a csíkokat 0,1 n kénsawal mossuk a bíborszín eltűnéséig. Ezután a csíkokat 3%-os hidrogén-peroxiddal kezeljük, míg a 50 papírban levő összes mangándioxid teljesen feloldódik. Végül a csíkokat vízzel mossuk hidrogén-peroxidra negatív reakció eléréséig, azután a papírcsíkokat megszárítjuk. 55 3. példa Négyzetméterenként 185 g súlyú Whatman 3 MM szűrőpapírból készült csíkokat 100 ml-enként 5g aktív klórt tartalmazó nátrium-hipoklorit-oldatban tartunk 5 órán át. Ezután alaposan kimossuk vízzel, 60 míg klórra kálium-jodid keményítős papíron negatív reakciót kapunk, azután megszárítjuk. 4. példa 15X30 cm-es Whatman 3 MM papírcsíkokat 16^65 órán át áztatunk 200 ml, 100 ml-enként 10 g aktív klórt tartalmazó nátrium-hipoklorit és 200 ml 4 n nátrium-hidroxid elegyében. A papírokat ezután negatív klórreakció eléréséig vízzel mossuk, azután megszárítjuk. 5. példa 100 g cellulózport 500 ml 4. példa szerinti oldattal kezelünk 5 órán át, azután addig mossuk vízzel, míg klórra negatív reakciót kapunk, és a mosóvizet semlegesnek találjuk. Végül a cellulózport levegőn megszárítjuk. 6. példa a) 6 cm széles szűrőpapírcsíkot, amelyet a 4. példa szerinti módon kezeltünk, kétszer átmossuk egy foszfátpufferrel, azután megszárítjuk (a pufferoldat 13,6 g kálium-dihidrogén-foszfátot tartalmaz, amelyet 800 ml vízben oldottunk, 6,8 pH eléréséhez szükséges mennyiségű 4 n nátrium-hidroxidot adtunk hozzá, végül 1000 ml-re feltöltöttük vízzel). A pufferoldatot ezután félretesszük. b) 100 mg aszkorbinsavat feloldunk 5 ml vízben. Hozzáadjuk 100 mg 2,6-diklór-fenolindolfenol (DCPIP) és 400 mg pohvinil-pirrolidon (PVP) 35 ml abszolút etanollal készített oldatát. Enyhén színes oldatot kapunk. (Az esetleges csapadékot centrifugálással eltávolítjuk). c)Az a) bekezdés szerinti előkezelt papírcsík közepére mintegy 5 mm szélességű hosszanti csíkban felvisszük a b) bekezdés szerinti redukált DCPIP oldatot, azután a csíkot megszárítjuk. d) Az a) bekezdésben említett foszfátpuffer 200 ml-éhez 16 ml 32%-os hidrogén-peroxid oldatot adunk. A c) bekezdés szerint felvitt DCPIP csíkot megszárítjuk, azután egy kis távolságra tőle egy ugyancsak mintegy 5 mm széles csíkot húzunk a foszfátpuffer-hidrogén-peroxid (Ph—H) oldatból, végül ez utóbbi csíkot is megszárítjuk. e) Szárítás után a papírt a- sávokra merőleges irányban 60 X 7 MM-es csíkokra vágjuk, tehát minden csík tartalmaz egy DCPIP zónát és egy Ph-H zónát. f) Egy feltehetően terhes nő vizeletének 0,1 ml-nyi mintájához, amelyben a humán chorion gonadotropint (HCG) kell meghatározni, 0,1 ml antiszérumot (nyúl anti—HCG-t) adunk, amely elegendő 0,2 egység HCG lekötéséhez. Mintegy 2 perc múlva HCG peroxidáz konjugát 0,1 ml-ként 0,2 egység HCG aktivitású oldatának 0,1 ml-ét adjuk a mintához. A keveréket 2 percig állni hagyjuk, miközben újra meg újra összerázzuk. Ezután cellulózhoz kötőt juh antinyúl-gamma-globulin szuszpenziót adunk hozzá. A szuszpenziót ezután 5 percig állni hagyjuk, miközben időnként többször összerázzuk. Ezután a felső folyadékfázist egy e) bekezdés szerint előkészített papírcsíkra szívatjuk. A csíkot oly módon merítjük a folyadékba, hogy a Ph-H csík a DCPIP csík alatt legyen. Szembetűnő kék színeződés mutatja a HCG-nek a vizeletmintában való jelenlétét. g) Az egész próbát megismételjük egy olyan papírcsíkkal, amelyet nem vetettünk alá oxidációs előkezelésnek. Igen halvány színváltozást tapasztalunk. 2