168313. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biotin mikrobiológiai úton történő előállítására

11 168313 12 koncentrációjú etanolos oldatának 2 ml-ét adjuk mindegyik lombikhoz, és a tenyésztést 30 °C hőmérsékleten további 5 napig folytatjuk. A tenyésztés befejezése után a fermentlét az 1. példában leírttal azonos módon kezelve 0,72 g biotint kapunk. A termék infravörös abszorpciós és NMR spektruma megegyezik a strandard termék spektrumaival. 7. példa Brevibacterium ketoglutamicum-ot (ATCC 21004) az előző példában leírttal azonos módon tenyésztve és a kapott fermentlét kezelve 0,35 g biotint kapunk. A termék infravörös abszorpciós spektruma megegyezik a standard termék spektrumával. 8. példa 5% n-paraffint, 0,5% ammónium-kloridot, 0,34% nátrium-hidrogén-szulfátot, 0,16% kálium-dihidrogénfoszfátot, 0,05% magnézium-szulfátot, 0,05% nátrium-klorid és 0,01% kukoricalekvárt tartalmazó 100 ml folyékony tápközeget 500 ml térfogatú Sakaguchi lombikba öntünk. Sterilezés után előzetesen azonos összetételű tápközegben tenyésztett 2% Candida arborea-val (IAM 4147) beoltjuk és 27 °C hőmérsékleten tenyésztjük. 20 óra elteltével a (II) képletű vegyület 50 mg/ml koncentrációjú etanolos oldatának 5 ml-ét adjuk hozzá, és a tenyésztést 5 napig folytatjuk. A kapott fermentlét az 1. példában leírttal azonos módon kezelve 162 mg biotint kapunk. A termék infravörös abszorpciós és NMR spektruma megegyezik a standard termék spektrumaival. 9. példa 5% n-paraffínt, 0,1% malátaextraktot, 0,2% ammónium-szulfátot, 0,4% káhum-dihidrogén-szulfátot, 0,6% nátrium-hidrogén-foszfátot, 0,02% magnéziumszulfátot, 1 mg/l vas-szulfátot 10 mg/l bórsavat, 10 mg/l mangán-szulfátot, 70 mg/l cink-szulfátot, és 50 mg/l réz-szulfátot tartalmazó 100 ml folyékony tápközeget 500 ml térfogatú Sakaguchi lombikba öntünk. Sterilezés után előzetesen azonos összetételű tápközegben tenyésztett Cunninghamella blakesleanaval (IFO 4433) beoltjuk, és 25 °C hőmérsékleten 3 napig tenyésztjük. Ezután a (II) képletű vegyület 50 mg/ml koncentrációjú etanolos oldatának 5 ml-ét adjuk hozzá, és a tenyésztést 7 napig folytatjuk. Ezután a biotint az 1. példában leírttal azonos módon elválasztva és tisztítva 140 mg súlyú kristályokat kapunk. A termék infravörös abszorpciós spektruma megegyezik a standard termék spektrumával. 10. példa A 9. példában leírttal azonos eljárással, de Gibberella fujikuori-t (ATCC 14842) használva 155 mg biotint kapunk. A termék infravörös abszorpciós spektruma megegyezik a standard termék spektrumával. 11. példa A 9. példában leírttal azonos eljárással, de Penicillium chrysogenumot (IAM 7326) használva 112 mg biotint kapunk. A termék infravörös abszorpciós spektruma megegyezik a standard termék spektrumával. 12. példa Az 1. példával azonos összetételű tápközegben tenyésztett Corynebacterium primorioxydans (B—321) 5 mg nyugvó sejtjeit 10 ml 0,05 mólos fosz-5 fát pufferben (pH 7,0) szuszpendáljuk. Ezután a (II) képletű vegyület 50 mg/ml koncentrációjú etanolos oldatának 0,2 ml-ét adjuk a szuszpenzióhoz, és a szuszpenziót éjszakán át 28 °C hőmérsékleten Monod típusú rázógépen inkubáljuk. Ezután a sejteket centri-10 fugálással eltávolítjuk, a felülúszó folyadékot betöményítjük. A terméket ebből választjuk el, és vékonyréteg kromatográfíával (benzol-metanol-aceton-ecetsav 7:2:0,5:0,5 arányú elegyével) tisztítva 3,5 mg biotint kapunk. A termék KBr pasztillás módszerrel 15 kapott infravörös abszorpciós spektruma megegyezik a standard termék spektrumával. 13. példa , A 6. példában említettel azonos összetételű tápkö-20 zegben tenyésztéssel kapott Arthrobacter parafíineus (ATCC 21003) sejteket megfagyasztjuk és szárítjuk. Ezután 200 mg súlyú sejtet szuszpendálunk 10 ml 0,05 mólos foszfát pufferben (pH 7,0). Ezután a (II) képletű vegyület 50 mg/ml koncentrációjú etanolos 25 oldatának 0,2 ml-ét adjuk a szuszpenzióhoz, és a szuszpenziót éjszakán át 26 °C hőmérsékleten rázógépen inkubáljuk. A sejteket a 12. példában leírttal azonos módon kezelve 3,0 mg biotint kapunk. A termék infravörös abszorpciós spektruma meg-30 egyezik a standard termék spektrumával. 14. példa A 9. példa szerinti eljárást ismételjük meg, azonban mikroorganizmusként Cladosporium herbarum 35 IFO 4458 törzset alkalmazunk. Ily módon 96 mg biotint kapunk. A termék infravörös abszorpciós spektruma megegyezik a standard termék spektrumával. 40 15. példa A 9. példa szerinti eljárást ismételjük meg, azonban mikroorganizmusként Peiücülium patulum ATCC 10120 törzset alkalmazunk. Ily módon 105 mg biotint kapunk. A termék infravörös abszorpciós 45 spektruma megegyezik a standard termék spektrumával. 16. példa A 9. példa szerinti eljárást ismételjük meg, azon-50 ban mikroorganizmusként Mucor microsporus ATCC 8541 törzset alkalmazunk. Ily módon 87 mg biotint kapunk. A termék infravörös abszorpciós spektruma megegyezik a standard termék spektrumával. 55 Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás az I képletű biotin előállítására azzal jellemezve, hogy a II képletű vegyületet valamely, a 60 Corynebacterium primoríoxidans, Pseudomonas mutabilis, Candida arborea, Cunninghamella blakesleana, Cladosporium herbarum, Giberella fujikuori, Penicillium chrysogenum, Penicülium patulum vagy Mucor microporus specieshez tartozó mikroorganiz-65 mussal, előnyösen Corynebacterium primorioxidans 6