168264. lajstromszámú szabadalom • Mikrokamra elektronoptikai berendezésekkel történő vizsgálatokhoz, célszerűen biológiai objektumok "in vitro" elektronmikroszkópos vizsgálatához

3 168264 4 Microscopie Electronique, Grenoble (1970), 171, Heide, H. G.: J. Cell. Biol. 13, 147 (1962), Stoyanova, I. G. es Mikhalovski, G. A.: Biofizika, SZU, 4, 483 (1959), Dupouy, G., Perrier, F., Durrieu, L.: Compt. Rend. 251, 2836 (1960), 5 Haie, K. F., Brown, H. és Allinson, 0. L.: Septième Congres International de Microscopie Electronique, Grenoble (1970), 297). Történtek próbálkozások ablak nélküli, azaz nyílt rendszerek alkalmazására is, ezek azonban 10 nem jártak kielégítő eredménnyel. A folyamatos mintabevitel problémáját nem tudták megoldani, nem is említve az esetleges biológiai reagensek bevitelét. További hátrányt jelent, hogy az elektronsugár útjába egyszer már bevitt, viszonylag nagy 15 mintacsepp az evakuált térrel érintkezve puffer-rendszer hiányában azonnal szétpattant vagy elpárolgott, és így a minta rendkívül rövid idő (néhány másodperc) alatt vizsgáihatatlanná vált. (Parson, D. F. és Moretz, R. C.: Septième Congres 20 International de Microscopie Electronique, Grenoble (1970), 497, Ward, P. R. és Mitchell, R. F.: Proc. 25th Anniversary Meeting of EMAG, Institute of Physics, London (1971).) A lefagyasztott szövetminták elektronmikrosz- 25 kópos vizsgálata mindeddig nem volt megfelelően megoldható. Elektronmikroszkópos vizsgálatra alkalmas méretű (kb. 1000 Â vastag) lefagyasztott szövetminták vágására alkalmas eszközök ugyan ismertek (ilyen például az LKB (Stockholm, Svéd- 30 ország) és a Reichert (Wien, Ausztria) cég Cryo ultramikrotom vágószerkezete), az így kapott vékony lemezek azonban az elektronmikroszkópba helyezve a nagy vákuum hatására víztartalmukat azonnal elveszítik, és vizsgálhatatlanná válnak. 35 Ezért a vizsgálandó szöveteket felmelegítés és preparálás után, száraz állapotban helyezik az elektronmikroszkópba. A hosszadalmas és bonyolult preparálási művelet hatására azonban a szövet legalábbis részben elroncsolódik, így a szövet 40 vizsgálata nem nyújt pontos információt. (Bemard, W. és Leduc, H. E.: J. Cell. Biol. 34, 757 (1967).) A találmány szerinti mikrokamra az ismert berendezések hátrányait kiküszöbölve egyszerű le- 45 hetőséget nyújt biológiai objektumok közel fiziológiás körülmények közötti vizsgálatára. E mikrokamra alkalmazásával lehetővé válik továbbá a lefagyasztott szövetminták közvetlen, tehát előkezelést, preparálást, és hasonló műveleteket nem 50 igénylő elektronmikroszkópos vizsgálata. Minthogy a találmány szerinti mikrokamrában a vizsgálandó objektum az elektronsugarakat átengedő furatokon keresztül közvetlen összeköttetésben áll az evakuált térrel, biztosítani kell a nagy vákuum szí- 55 vóhatásának kompenzálását. Ezt a szerepet tölti be a találmány szerinti mikrokamrában alkalmazott nyomásellensúlyozó puffer-rendszer. E puffer-rendszer beiktatásával egyrészt közel fiziológiás körülményeket biztosíthatunk, másrészt megaka- 60 dályozhatjuk a minta gyors szétpattanását vagy folyadékvesztés révén bekövetkező károsodását. A találmány szerinti mikrokamra szerkezeti felépítését és működési elvét a csatolt 1. ábrára hivatkozva ismertetjük. 65 Az 1. ábrán feltüntetett mikrokamra egytengelyűén kialakított vagy centrálással egytengelyűvé tehető 2 bemeneti és 3 kimeneti nyílással ellátott 1 burkolatból, az 1 burkolatban elhelyezett 4 preparátumtartóból, valamint a mikrokamrához csatlakozó 8 nyomásellensúlyozó puffer-rendszerből áll. Az 1. ábrán bemutatott mikrokamra a biológiai objektumok, illetve lefagyasztott szövetminták vizsgálatán kívül bármilyen objektum elektronmikroszkópos vizsgálatához alkalmazható, amelynél feltétlenül szükséges vagy előnyös az evakuált tér hatásának kompenzálása. Minthogy a találmány szerinti mikrokamra egy speciális kiviteli formája folyamatos minta- és/vagy reagens-bevitelt is lehetővé tesz, kiválóan alkalmas fizikokémiai, kémiai és biokémiai reakciók tanulmányozására is. Tekintettel arra, hogy a találmány szerinti mikrokamra legfontosabb alkalmazási területének a biológiai objektumok vizsgálata tűnik, a következőkben a mikrokamrát elsősorban a biológiai alkalmazási terület vonatkozásában ismertetjük, anélkül azonban, hogy találmányunkat erre az alkalmazási területre korlátoznánk. Az 1. ábrán feltüntetett, a mikrokamrához a 7 csövön keresztül csatlakozó 8 nyomásellensúlyozó puffer-rendszer tartály lehet, amelyben folyadék helyezkedik el. A tartályból a- 7 csövön folyadékgőz, illetve adott esetben folyadék kerül a mikrokamrába, amely kompenzálja a minta párolgását és a mintával a bemeneti és kimeneti nyílásokon keresztül érintkező evakuált tér hatását, vagyis a minta környezetében biztosítja a fiziológiás körülményekhez szükséges nyomást, ugyanakkor biztosítja a vizsgálandó objektum életfeltételeihez szükséges körülményeket (például a nedves atmoszférát). A folyadéktartályba olyan folyadékot töltünk, amely a vizsgálandó mintát nem károsítja, illetve az adott esetben végrehajtott biológiai reakciót nem zavarja. A folyadék célszerűen víz lehet. Adott esetben a tartályban reagenst is elhelyezhetünk, amely a mintára jutva reakciót vált ki. Ilyen reagensek például a kontraszt-anyagok. A 8 nyomásellensúlyozó puffer-rendszer megfelelő nyomásszabályozóval, például tűszeleppel ellátott gáztartály vagy gáztérrel érintkező csőcsonk is lehet. Ez a kialakítás elsősorban a lefagyasztott minták esetén előnyös, amikor csak nyomáskompenzálásra van szükség, nedves atmoszféra fenntartására azonban nem. A bevezetett gáz célszerűen levegő lehet. A gázzal együtt - a fentiekhez hasonlóan — adott esetben reagenst is juttathatunk a mintára. A burkolaton kialakított két egytengelyű vagy centrálással egytengelyűvé tehető nyílás célszerűen azonos vagy legföljebb egy nagyságrenddel eltérő átmérőjű nyílás lehet, amelyeken keresztül az elektronsugár áthalad a mintán. A nyílás átmérője 30-100 n lehet, szükség esetén azonban ennél nagyobb vagy kisebb átmérők is alkalmazhatók. Ha a mikrokamra burkolata egy darabból van kialakítva, a 2 bemeneti és a 3 kimeneti nyílásnak feltétlenül egytengelyűnek kell lennie. A mikrokamra burkolatát azonban két, egymáshoz képest elmozdítható részből is kialakíthatjuk, ekkor a 2