168234. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 20béta-hidroxi-9- oxo-1,2,3,4,10,19-hexa-nor- 5,9-szekopregnán-5-karbonsav előállítására
3 168234 4 alkalmazhatunk. Asszimilálható nitrogén-forrásként állati, növényi és mikróbás eredetű, valamint szervetlen nitrogén-vegyületek jöhetnek tekintetbe (pl. húsextrakt, peptonok, kukoricalekvár, élesztőextrakt, glicin és nátriumnitrát). Szénforrásként 5 cukrok (pl. glükóz) és elsősorban maga a fermentálandó szteroid szolgálhat. A táptalaj továbbá nyomelemeket (pl. vasat, ként és foszfort), továbbá növekedési faktorokat (pl. vitaminokat, mint pl. biotint, vagy piridoxint) vagy auxinokat (pl. 10 indolil-ecetsavat) tartalmazhat. A fertőzésekkel szemben való védelem céljából a táptalajt sterilezhetjük és/vagy az idegen organizmusok növekedését gátló anyagokat (pl. benzoátokat, antibiotikumokat stb.) adhatunk hozzá. A fermentálást előnyösen 15 semleges vagy enyhén savas pH-tartományban (pl. 6-7 pH-értéken) végezhetjük el. A fermentáció hőfoka 18C° és 40 C° közötti érték, előnyösen 28 C° körüli hőmérsékleten dolgozhatunk. 20 A kiindulási anyagként felhasznált szteroidot előnyösen oldat (pl. dimetilszulfoxiddal, dimetilformamiddal, etanollal vagy acetonnal képezett oldat) alakjában adhatjuk a tenyészethez. Azt találtuk, hogy előnyösen járhatunk el oly módon, 25 hogy a szteroidot részletekben adjuk a fermentációs közeghez és minden újabb hozzátét előtt megvárjuk az előzőleg hozzáadott szteroid-mennyiség lebontását. 30 A fermentáció befejezése után az eljárás termékét a fermentléből önmagában ismert módon (pl. extrakció, ellenáramú extrakció vagy kromatográfia segítségével) izolálhatjuk. A 20/3-hidroxi-9-oxo-l,2,3,4,10,l9-hexa-nor-5,9- 35 -szeko-pregnán-5-karbonsavat mindezideig nem írták le. Ez a vegyület szteroid-szintézisek értékes közbenső terméke és ismert módszerekkel analóg módon alakítható szteroidokká (lásd a 741 826 sz. belga szabadalmi leírást). 40 A kiindulási anyagként felhasznált szteroidot a Fieser-Fieser: Steroids (1959) 567. és 572. oldal irodalmi helyen írták le. 45 Az eljárás további részleteit az alábbi példákban ismertetjük anélkül, hogy a találmányt a példákra korlátoznánk. 50 1. példa Fermentációs táptalaj előállítása Ci4_i8-alkánokon adaptált Mycobacterium 55 phlei ATCC 19249 törzset ferde agar tenyészetekről az alábbi összetételű táptalajra oltunk át: Difco táptalaj 23 g Ci4_i8-alkánok 10 ml 60 Nyomelem-oldat 1 ml Desztillált víz 1000 ml A nyomelem-oldat 1000 ml desztillált vízben az alábbi komponenseket tartalmazza: 65 11 g ZnS04-7H 2 0, 6 g MnS04 • 4H 2 0, lg FeS04 -7H 2 0, 0,3 g C0SO4 • 7H20, 0,04 g CuS04 • 5H 2 0, 0,06 g H3BO3, 0,01g KJ, 5g etiléndiamintetraecetsav. A tenyészeteket 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban 100-100 ml tápoldattal 48 órán át 28 C°-on forgó rázatógépen (fordulatszám: 160 fordulat/perc) tenyésztjük. A kapott tenyészetekkel 7 literes kisfermentorban levő alábbi összetételű táptalajt oltunk be: 30,200-dihidroxi-pregn •5-én 4 NH4 N0 3 2g KH2 P0 4 lg K2 HP0 4 lg Na2 HP0 4 • 2H 2 0 lg MgS04 • 7H 2 0 0,2 g KCl 0,2 g FeS04 • 7H 2 0 0,001 g Csapvíz, pH = 7 1000 ml A tenyészeteket 15 napon át 28C°-on levegőztetés és. keverés közben inkubáljuk. A kapott tenyészetekből szénforrásként csak 3/3,200-dihidroxi-pregn-5-ént tartalmazó agar-lemezekre mintákat veszünk. Az agar-lemezeket a fenti összetételű táptalajból 2% agar hozzáadásával állítjuk elő. Az agar-lemezek készítését 5-10-szer megismételjük, ez alatt az agar-lemezek szteroid-tartalma 1%-ra emelkedik. Az eljárást a szokásos módon, meghatározatlan számú sejtet tartalmazó baktérium-szuszpenziónak a lemezre való felvitelével és Trigalski-spatulával való szétdörzsöléssel végezzük el. A növekedési ciklus 5 napig tart. Végül olyan agar-lemezeket alkalmazunk, melyek szénforrásként csak 2O0-hidroxi-9-oxo-l,2,3,4,lO,19,hexa-nor-5,9--szeko-pregnán-5-karbonsavat tartalmaznak. A találmány szerinti fermentációs eljáráshoz azokat a tenyészeteket alkalmazzuk, melyek ezeken a lemezeken nem mutatnak növekedést. A tenyészetek fenntartása céljából a biomasszából 10%-os steril soványtej-oldatban szuszpenziót készítünk, melyet 2 ml-es ampullákba töltünk és folyékony nitrogén alatt tárolunk. Aktivitáscsökkenést 2 év után sem tapasztaltunk. 2. példa 100 ml alábbi összetételű táptalajt: glükóz (külön sterilezve) 1% NH4 N0 3 0,2% KH2 P0 4 0,1% K2 HP0 4 0,2% Na2 HP0 4 • 7H 2 0 0,1% MgS04 • 7H 2 0 0,02% KCl 0,02% FeS04 • 7H 2 0 0,0001% (csapvízzel készült, nátriumhidroxiddal pH = 7,0 értékre beállított táptalaj) az 1. példa szerint előállított 2 ampulla tartalmával beoltunk. A tenyészetet 48 órán át 28 C°-on rázatás közben 2
