168121. lajstromszámú szabadalom • Eljárás aminoglikozid-antibiotikumok előállítására
15 168121 16 B) Oltóanyag előállításának második szakasza 10 literes fermentorba steril körülmények között betöltjük a következő alkotórészeket tartalmazó 6 liter vizes tápközeget: szójababliszt 210 g dextrin 300 g dextróz 30 g kalciumkarbonát 42 g kobaltklorid 12 mg metilpolisziloxán habzásgátló 3ml Ezután aszeptikus körülmények között hozzáadjuk az ennek a példának az A) szakaszában készült 600 ml oltóanyagot, és a keveréket percenkint 500 forulattal való keverés és percenként 5 liter levegővel való levegőztetés közben 34 C°-on, 22-26 óra hosszat fermentáljuk; így legalább 15-20%-os „tömör sejttérfogat"-ot kapunk. C) Antibiotikum termelés Előállítjuk a következő alkotórészeket tartalmazó 90 liter steril táptalajt: szójababliszt 3,15 kg dextrin 4,5 kg dextróz 450 g kobaltklorid 200 mg kalciumkarbonát 630 g metilpolisziloxán habzásgátló 100 ml Sterilizálás után a pH-t szükség szerint híg savval vagy híg lúggal 7,3-ra állítjuk be, és Hozzáadunk ennek a példának a B) szakasza szerint előállított 6 liter oltóanyagot. A keveréket 34 C°-on, 6,7 és 8,3 közötti pH-nál, percenként 0,032 m3 levegővel levegőztetve és percenként 200—400 fordulattal keverve fermentáljuk. 24 órai fermentálás után a fentebb ismertetett eljárással meghatározzuk az antibiotikum koncentrációját, majd a meghatározást 12 órai időközökben a maximális termelés eléréséig ismételjük. Ezután a 3. példa szerint eljárva az antibiotikumtermékeket elkülönítjük. 3. példa Az antibiotikum keverék elkülönítése A fermentléhez keverés közben 630 g oxálsavat adunk, és a keverék pH-ját 6n kénsawal 2-re állítjuk be. 20 percnyi keverés után a keveréket szűréssel elválasztjuk. A micélium-szűrőlepényt vízzel mossuk, és a mosófolyadékot és a megszűrt fermentlevet egyesítjük, majd az egyesített szüredéket és a mosófolyadékot 6n vizes ammómumhidroxid-oldattal közömbösítjük. A közömbösített fermentlevet 5 cm átmérőjű és 66 cm magas, ammóniumfázisú Amberlite IRC-50 ioncserélő gyantaoszlopoh átfolyatva az antibiotikum-komplexet adszorbeáltatjuk a gyantán. A gyantaágyat a maradék fermentlé eltávolításáig (a mosófolyadék színtelenné válásáig) ionmentesített vízzel mossuk, és az oszlopot 2n vizes ammóniumhidroxid-oldattal addig eluáljuk, amíg a kifolyó oldat erősen bázisos nem lesz (a pH értéke 10 vagy ennél nagyobb), majd ionmentesített vízzel mossuk. Az eluátumot és a mosófolyadékot színtelenítés céljából előre elkészített Amberlite IRA-4015 (hidroxilfázisú) gyantaoszlopon folyatjuk át; az oszlop méretei legalább olyanok legyenek, mint az Amberlite IRC-50 oszlopé. Az Amberlite IRA-4015 oszlopból kifolyó oldatot és mosófolyadékot egyesítjük, és 5 vákuumban 4,3 literre bepároljuk. 100 ml koncentrátumot liofilizálva 1,6 g JI-20 antibiotikum-komplexet kapunk. Hatékonysága Staphylococcus aureus mikroorganizmussal szemben 591 ßglmg, míg a gentamiciné 1000/Lig/mg. Ezt az elválasztást az egésznek 1/43-ad 10 részével végeztük. A JI-20 antibiotikum-komplex összes kitermelése így 66,8 g. 4. példa A JI—20 antibiotikum-komplex szétválasztása 15 A3, példa szerint kapott 1,5 g JI-20 antibiotikum-komplexet kovasavgéloszlopon kromatografáljuk. Eluálószerként kloroform, metanol és tömény vizes ammóniaoldat 1:1:1 arányú keverékének alsó fázisát használjuk. Az oszlop működését úgy ellenőrizzük, 20 hogy minden felfogott frakcióból mintát veszünk, és azt kovasavgél vékonylemezen kromatografáljuk, majd Staphylococcus aureus ATCC 6538 P mikroorganizmussal szemben bioautografálást végzünk. Az egyes antibiotikum-komplexeket tartalmazó eluátum-25 frakciókat egyesítjük, vákuumban 50-100 ml-re bepároljuk, és liofilizáljuk. így az oszlopból való kilépés sorrendjében 30 mg gentamicint, 740 mg JI-20B antibiotikumot és 170 mg JI-20A antibiotikumot kapunk. Az így előállított tiszta JI-20B antibiotikum 30 hatékonysága 1000 jug/mg. 5. példa A JI-20 antibiotikum-komplex szulfátjának előállí-35 A 3. példa szerint előállított 7,5 g JI-20 antibiotikum-komplexet 60 ml vízben oldjuk, a pH-ját 12n kénsawal beállítjuk 4,0-ra, majd aktívszenet adunk hozzá, és 30 percig keverjük. Az oldatot megszűrjük, és 650 ml metanolba öntjük. A kivált terméket 40 szűrőn elválasztjuk, metanollal mossuk, és csökkentett nyomáson 55 C°-on szárítva a cím szerinti terméket kapjuk, [a]^ = +119° (vízben). Biológiai hatékonysága 516 /-(g/mg. 45 6. példa A JI-20 antibiotikum-komplex hidrokloridjának előállítása 2,0 g JI-20 antibiotikum-komplexet 15 ml vízben oldunk, és keverés közben 3,6 pH érték eléréséig 6n 50 sósavat csepegtetünk hozzá, majd aktívszenet adunk hozzá, és 15 percig tovább keverjük. Az oldatot megszűrjük, és a szüredéket 500 ml acetonba öntjük. A felülúszó folyadékot a keletkezett gyantás termékről leöntjük. A visszamaradt gyantás anyagot vízben 55 oldva és liofilizálva a kívánt terméket kapjuk. Olvadáspontja 208-213 C° (bomlik). [a]£ = +128° (vízben). 7. példa 60 AJI-20B antibiotikumszulfát előállítása A 4. példa szerint kapott 3 g JI-20B antibiotikumot 24 ml vízben oldjuk, az oldat pH-ját 6n kénsawal beállítjuk 4,0-re, majd aktívszenet adunk hozzá, és 30 percig keverjük. Az oldatot megszűrjük, és 250 ml 65 metanolba öntjük. A kicsapódott terméket szűrőn 8
