168001. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3-nitro-4-hidroxi-2(1H)-kinolin-származékok előállítására
13 168001 14 és az elegyet 2,5 percig gőzfürdőn melegítjük. A vörös oldatból hűtésre sötétsárga szilárd anyag válik ki. Az elegyet etanollal hígítjuk, a szilárd anyagot leszűrjük, etanollal alaposan mossuk, és ecetsav és etanol elegyéből átkristályosítjuk. 167-169 C°-on olvadó 1-fenil-3-nitro-4-hidroxi-2(lH>kinolinont kapunk. Elemzés a C15 H 10 N 2 0 4 képlet alapján: számított: C:63,83%, H:3,57%, N:9,92%; talált: C:64,13%, H:3,70%, N:9,85%. 24. példa a) 1,6,7-Trimetil4-hidroxi-2(lH)-kinolinon 30,0 g (0,168 mól) 4,5-dimetil-N-metil-antranilsav (op.: 190-191 °C), 75 ml jégecet és 75 ml ecetsavanhidrid elegyét 4 órán át visszafolyatás közben forraljuk. A sötét oldatot lehűtjük, zúzott jégre öntjük, az elegyet pH = 9 értékre lúgosítjuk, és szűrjük. A szűrletet tömény sósavoldattal pH = 5 értékre savanyítjuk, és a kivált fehér, szilárd anyagot etanolból átkristályosítjuk. 300-305 C°-on olvadó 1,6,7-trimetil-4-hidroxi-2(l H)-kinolinont kapunk. Elemzés a C12 H 13 NOj képlet alapján: számított: C: 70,92%, H:6,45%, N:6,89%; talált: C: 70,12%, H:6,30%, N: 7,12%. b) l,6,7-Trimetil-3-nitro-4-hidroxi-2(lH>kinolinon 1,8 g (0,009 mól) l,6,7-trimetil-4-hidroxi-2(lH)kinolinont a 23. példa b) lépésében leírt módon nitrálunk. Etanolos átkristályosítás után 220-224 C°-on bomlás közben olvadó 1,6,7-trimetil-3-nitro-4-hidroxi-2(lH)-kinolinont kapunk. Elemzés a C12 H 12 N 2 0 4 képlet alapján: számított: C: 58,06%, H:4,87%, N: 11,29%; talált: C: 58,15%, H: 5,03%, N: 11,34%. Biológiai vizsgálatok és azok eredményei Az (I) általános képletű 3-nitro-4-hidroxi-2(lH> kinolinon-származékok biológiai hatását patkányon vizsgáljuk, a passzív kután anafílaxis (PCA) módszerrel. A hatóanyagokat nátriumsóik formájában adjuk be. Az oldható nátriumsókat pH = 7,2 értékű foszfátpuffer-oldatban oldva, míg az oldhatatlan nátriumsókat 1%-os metilcellulózban szuszpendálva adjuk be. Mota módszerével (Immunology 7, 681 (1964)) patkányok vérszérumában hőérzékeny homocitotróp antitesteket fejlesztünk ki. 250-300 g testsúlyú hím Wistar patkányoknak intraperitoneális injekció formájában 0,5 ml Bordetella pertussis vakcinát (4xlO10 elölt mikroorganizmus/ml) és szubkután injekció formájában 0,5 ml ovalbumin-emulziót (100 mg ovalbumin 2 ml fiziológiás sóoldattal és 3 ml nem-teljes Freund-féle adjuvánssal (3 súlyrész ásványolaj + 2 súlyrész 7,2 pH-értékű foszfátpuffer) készített emulziója) adunk be. A 18. napon a patkányokat szívpunkturával kivéreztetjük, az állatok vérét egyesítjük, a vérszérumot elválasztjuk, —20 C°-on tároljuk, és csak felhasználáskor melegítjük fel. A PCA-vizsgálatot Ovary és Bier (Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 81, 584 (1952)), illetve Goose és Blair •(Immunology 16, 769 (1969)) módszeréhez hasonlóan végezzük. A fentiekben előalított vérszérumokból kétszeres hígítási lépésekkel sorozathígítást készítünk. A sorozat 6 egymásutáni tagjából 0,1-0,1 ml-es mintákat veszünk, és a mintákat intradermális injekció formájában 250-350 g testsúlyú hím Wistar patkányok 5 borotvált hátbőrének 6 különböző helyére fecskendezzük. 72 óra elteltével a patkányoknak intravénás úton 0,3 ml 1%-os ovalbumin-oldat és 0,1 ml 5%-os „pontamine" égszínkék színezék-oldat (gyártja a Raymond Lamb. Ltd., London) elegyét adjuk be 10 (mindkét esetben oldószerként Sörensen-pufferoldattal 7,2 pH-értékre pufferolt izotóniás nátrium-kloridoldatot használunk). 20 perc elteltével a patkányokat leöljük, és megmérjük az antitest-injekciók beadásának helyén kialakult kék korongok átmérőit. A 15 felhasznált szérumhígításokat úgy választjuk meg, hogy a legnagyobb hígítású szérumminta beadásának helyén reakció ne lépjen fel, míg a maximális reakció a két vagy három legkisebb hígítású szérumminta beadásának helyén jelentkezzen. A jelen esetben 20 1/4-estől 1/128-os hígításig terjedő hat kétszeres hígítású szérummintát használunk fel. Megvizsgáljuk, hogy az (I) általános képletű vegyületek milyen mértékben csökkentik az antitest-injekciók beadásának helyén kialakult korongok átmérőit. 25 Csak azokat a korongokat vizsgáljuk, ahol a kontrollóknál az antigén-antitest reakció mértéke a maximálisnál kisebb volt. A hatóanyagot foszfátpufferrel készített oldat, illetve 1%-os metilcellulózzal készített szuszpenzió formájában, szubkután injekcióban adjuk 30 be az állatok nyakszirtjébe. Minden egyes kísérlethez 6—6 állatból álló állatcsoportot használunk fel, és a hatóanyagot meghatározott idővel az intravénás ovalbumin-injekció beadása előtt fecskendezzük be. A kísérleti állatcsoportban észlelt átlagos korongátmérőt 35 összehasonlítjuk az azonos körülmények között tartott, azonban hatóanyaggal nem kezelt, 6 állatból álló kontroli-csoportnál észleltekkel. A kontroli-csoportba tartozó állatok a hatóanyag-tartalmú injekció mellett azonos térfogatú tiszta hordozóanyagot tartalmazó 40 injekciót kapnak. A %-os gátlást az alábbi képlettel számítjuk ki: %-os gátlás = 100 (1 - a/b) 45 ahol a = a hatóanyaggal kezelt állatokon észlelt korongátmérők összegének átlaga, és b = a kontroli-állatokon észlelt korong-átmérők összegének átlaga 50 (mindkét esetben csak azokat a korongokat vesszük figyelembe, ahol a kontrollállatok a maximálisnál kisebb mértékű antigén-antitest reakciót adnak). Az (I) általános képletű vegyületeket előnyösen 55 7,2 pH-értékű pufferoldattal készített, nátrium-hjdrogén-karbonáttal semlegesített Oldatuk formájában adjuk be. Az oldhatatlan nátriumsót képező vegyületek esetén a szabad nitro-vegyületet 2,5 n nátrium-hidroxid-oldattal kezeljük, a kialakult nátriumsót elkülö-60 nítjük, szűrjük, vízzel lúgmentesre mossuk, szárítjuk, majd a sót 1%-os metilcellulózban szuszpendálva adjuk be. A biológiai kísérletek eredményeit az 1. táblázat-65 ban közöljük. 7
