167968. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cefalosporin-származékok előállítására

167968 5 6 formájában alkalmazhatók. Sókra példaként a sósavas sót vagy a nátrium- vagy káliumsót említhetjük meg. A találmány szerinti eljárásban a Mycoplana, Protaminobacter, Acetobacter, Xanthomonas, Pseudomonas, Aeromonas, Escherichia, Staphylococcus, Arthro- 5 bacter, Proteus, Corynebacterium, Flavobacterium, Clostridium, Spirillum vagy Bacillus nem olyan mikroorganizmusait alkalmazzuk, amely a-szubsztituált a-aminosavból és (III) általános képletű 7-aminocefém-származékból (I) általános képletű cefalosporin- 10 származékot tud előállítani. Dyen mikroorganizmusokként alkalmazhatók a mikroorganizmusok deponált törzsei és a természetes forrásokból, így talajból, csatornavízből, tengervízből, virágokból, gyümölcsökből és a levegőből elkülönített egyedek. 15 A cefalosporin-szintetizáló tulajdonsággal rendelkező mikroorganizmusok szelekciója úgy történik, hogy a vizsgálandó mikroorganizmusokat 10 mg/ml D-fenilglicin-metilésztert és 5 mg/ml 7-amino-3-dezacetoxicefalosporánsavat tartalmazó 6,0 pH-jú oldat- 20 ban szuszpendáljuk, a szuszpenziót 30 percen keresztül 37 Cc-on rázatjuk, majd a keletkezett 7-(a-amino-D-fenilacetamido)-3-dezacetoxi-cefalosporánsav menynyiségét a később ismertetendő bioautográfiás és biológiai módszerrel meghatározzuk. Az így kiválasz- 25 tott mikroorganizmusok közül előnyösen azokat alkalmazzuk, amelyek a fenti eljárás során legalább 1 mg/ml koncentrációban szintetizálnak 7-(a-amino-D-fenilacetamid)-3-dezacetoxicefalosporánsavat. Ha a fentiek szerint szelektált mikroorganizmus 30 olyan nemkívánatos enzimeket - például 0-laktamáz Ií-t (cefalosporinázt) vagy észterázokat - termel, amelyek a célvegyület (I) általános képletű cefalosporin-származékokat átalakítják, a mikroorganizmusból olyan mutánsokat állíthatunk elő, amelyek nem ter- 35 melnek nemkívánatos enzimeket. A mutánsképzést önmagában ismert módszerrel hajtjuk végre, így a mikroorganizmus Röntgen-sugárral, ultraibolya fénynyel vagy nitrogénmustár-származékokkal történő kezelésével. 40 Az alábbiakban felsoroljuk azoknak az Institute for Fermentation (Osaka, Japán) intézetnél letétbe helyezett törzsek egy részét, amelyek a találmány szerinti eljárásban alkalmazhatók. (Az „IFO" jelzéssel ellátott számok a mikroorganizmus iktatási számai az 45 említett intézetekben.) Acetobacter acetosus IFO-3296, Gluconobacter albidusIFO-3251, Acetobacter aurantium IFO-3245, IFO-3249, Gluconobacter cerinus IFO-3262, Gluconobacter indunstrius IFO-3260, Gluconobacter dioxyacetonicus IFO-3272, 50 Gluconobacter gluconicus IFO-3171, Gluconobacter liquefaciens IFO—12388, Gluconobacter melanogenus IFO-3293, Gluconobacter oxydansIFOr3189, Acetobacter pasteurianus IFO—3223, Gluconobacter suboxydans IFO—3130, Acetobacter turbidans IFO- 55 3225, Acetobacter xylinum IFO-3144, IFO-3288, Xanthomonas citri IFO-3835, IFO-3829, Xanthomonas pruni IFO-3780, Xanthomonas oryzae IFO-3995, IFO-3827, IFO-3828, IFO-3510, Pseudomonas aeruginosa IFO—3454, Pseudomonas maltophila 60 IFO—12690, Pseudomonas melanogenum IFO— 12020, Pseudomonas vendrelli IFO-3899, Aeromonas hydrophila IFO—3820, Arthrobacter simplex IFO-12069, Arthrobacter oxydans IFO-12138, Proteus mirabilis IFO-3849, Proteus morganii IFO- 65 3848, Corynebacterium tritici IFO-12164, Flavobacterium capsulatum IFO-12533, Clostridium butyricum IFO—3847, Clostridium acetobutyricum IFO-3346, Staphylococcus aureus IFO-3060, Spirillum metamorphum IFO—12012, Bacillus subtilis IFO— 3035, Bacillus sphaericus IFO-3526, Bacillus firmus IFO-3330, Bacillus pumilus IFO-12090, Escherichia coli IFO—3543 és Escherichia coli var. communior IFO-3550, Xanthomonas campestris (NARI X 1—1—1), Xanthomonas Cucurbitae (NARI X 1—3—1), Xanthomonas hyacinthi (NARI X 1-6-1), Xanthomonas phaseoli f. sp. sojense (NARI X 1—7—1), Xanthomonas physalidicola (NARI X 1—8-1), Xanthomonas pisi (NARI X 1-9-1), Xanthomonas translucens (NARI X 1—11—2), Pseudomonas aureofaciens (IFO—3522), Pseudomonas cönvexa (IFO— 12653), Pseudomonas putrefaciens (IFO—3908) és Pseudomonas taetrolens (IFO-12691), valamint Xanthomonas phaseoli f. sp. alfalta (NARI X 1-6-1). A találmány szerinti eljárásban alkalmazható/természetes forrásból származó mikroorganizmusokra az alábbi példákat említjük meg: Mycoplana dimorpha IFO 13213, IFO 13240, Mycoplana bullata IFO-13267, Protaminobacter albofalvus IFO-13221 és Acetobacter sp. IFO-13209. Az (I) általános képletű cefalosporin-származékok (II) általános képletű a-szubsztituált a-aminosavakból és (III) általános képletű 7-aminocefém-származékból történő előállítására képes mikroorganizmusok a fent említett 15 nemben találhatók. Különösen sok jó eredményt biztosító mikroorganizmus található az alábbi nemek egyedei között: Mycoplana, Protaminobacter, Acetobacter, Xanthomonas, Pseudomonas, Aeromonas, továbbá a Pseudomonaceae családhoz tartozó 6 nem között. Az Escherichia nem alkalmazásával szintén jó eredményt lehet elérni. Az a-szubsztituált a-aminosav és a 7-aminocefémszármazék enzimes kezelését úgy is megvalósíthatjuk, hogy az említett mikroorganizmusokat az a-szubsztituált a-aminosavat és a 7-aminocefém-származékot tartalmazó tápközegben tenyésztjük, általában azonban előnyösebb, ha a szóban forgó mikroorganizmusokat előzetesen szokásos összetételű tápközegben tenyésztjük, majd a kapott fermentlevet alkalmazzuk — feldolgozás nélkül vagy feldolgozás után — a találmány szerinti átalakítás megvalósítására. A mikroorganizmusok tenyésztését levegőztetés közben keverés mellett, rázás közben vagy sztatikus körülmények között valósíthatjuk meg. Általában az aerob körülmények között végzett tenyésztés az előnyös. A tenyésztésre alkalmazott tápközeg húsextraktumot, élesztőextraktumot, peptont, kazeinhidrolizátumot, kukoricalekvárt és egyéb tápközegként használt természetes tápanyagokat tartalmazhatnak, alkalmazható azonban az említett tápanyagok tetszés szerinti kombinációja is. A tápközeg adott esetben a következő anyagokat is tartalmazhatja: szénforrásokat, így cukrokat, szerves savakat, norma paraffinokat, olyan szervetlen vagy szerves nitrogénvegyületeket, amelyekben a nitrogén aminocsoport és/vagy nitrátgyök formájában van jelen, foszfátokat, mangánsókat, nátrium-kloridot, egyéb ionos fémeket és/vagy vitaminokat. A közeg pH-ját előnyösen 6—8 közötti értékre állítjuk be. A tenyésztést 20—40 C°-on, célszerűen 3