167968. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cefalosporin-származékok előállítására
25 167968 26 ránsavat tartalmaz. Az elegyet 1 órán keresztül rázás közben 37 C°-on inkubáljuk. Az „enzimatikus úton végzett elemzés szerint az elegy a fenti idő után 1,35 g 7-(a-amino-l '-ciklohexeml-acetamido)-3-dezacetoxicefalosporánsavat tartalmaz. 5 A sejteket ezután centrifugálással eltávolítjuk a reakcióelegyből és felülúszó fázist 800 ml kereskedelmi forgalomban kapható polistirol-alapú adszorbenssel töltött oszlopon engedjük keresztül. [Az oszlop a Rohm and Haas Co (USA) cég által forgalomba *0 hozott „Amberlite XAD-2" adszorbenst tartalmazza.] Az oszlopot először 2600 ml vízzel, majd 1400 ml 5:1 térfogatarányú víz-metanol keverékkel mossuk, végül 2500 ml 50%-os vizes metanol-oldattal eluáljuk. 15 Az 50%-os metanolos eluátum első 800 ml-ét vákuumban kb. 35 C°-os szárazra párolva 135 mg kristályos 7-[a-amino-(L-1 '-ciklohexenil)-acetamido] -3-dezacetoxicefalosporánsavat kapunk. Ultraibolya adszorpció: E]%m = 205 (260 /um). 20 Fajlagos forgatás: (á)2 £ = +137° (c = 0,5 víz). A metanolos eluátum további 700 ml-ét vákuumban, kb. 35 C°-on szárazra párolva 850 mg kristályos 7- [a-amino-D(-l '-ciklohexenil)-acetamido]-3-dezacetoxicefalosporánsavat állíthatunk elő. 25 Ultraibolya adszorpció: E\*m =215 (260 /mi). Fajlagos forgatás: (a)^ = +86,2° (c = 0,5 víz). Mágneses rezonancia-spektrum: oldószer: D2 0(pH = 3). eltolódás (5): 1,66 (széles, 4H), 2,10 (széles, 4H), 2,20 (szingulett, 3H), 3,54 (AB-típusú kvartett, 2H), 30 4,63 (szingulett, 1H), 5,19 (duplett, 1H), 5,72 (duplett, 1H), 6,18 (széles, 1H). A termék antibakteriális hatását a 17. táblázatban foglaltuk össze. 35 17. táblázat Hatásosság vizsgálatra alkalmazott Minimális gátló mikroorganizmus koncentráció (Mg/ml) 40 Staphylococcus aureus 209P 0,5 Staphylococcus aureus No. 87 2 Bacillus subtilis PCI 219 0,2 Sartina lutea PCI 1001 0,02 45 Escherichia coli NIHJ 50 Klebsiella pneumoniae Kbl 50 Proteus vulgaris Eb51 50 Proteus morganii Eb53 >100 Proteus morganii Eb54 >100 50 Proteus mirabilis Eb59 100 Pseudomonas aeruginosa Pdl >100 Pseudomonas aeruginosa 10 490 >100 24. példa 55 Xanthomonas citri IFO—3835 1 napos tenyészetével 50 ml III. tápközeget inokulálunk, majd a közeget 1 napon keresztül 28 C°-on rázatjuk. A kapott tenyészetet átoltjuk 350 ml III. tápközegbe és rázás közben 1 napon keresztül inkubáljuk. 60 A sejteket ezután centrifugálással elkülönítjük és 100 ml desztillált vízben szuszpendáljuk. A szuszpenzióhoz hozzáadunk 8 g D-feniíglicin-metilésztert és 100 ml desztillált vízben oldott 4 g 7-amino-3-dezacetoxicefalosporánsavat. Az elegyet 1 órán keresztül 37 C°-on 65 rázatjuk, miközben pH-ját 2N nátrium-hidroxid-oldat adagolásával 6,0 értéken tartjuk. A fenti idő után az elegy az enzimes úton végzett elemzés szerint 24,7 mg/ml 7-(a-aminofenilacetamido)-3-dezacetoxicefalosporánsavat tartalmaz. A reakcióelegyet a 23. példában ismertetett módon feldolgozva 3,9 g kristályos 7-(a-amino-D-fenilacetamido)-3-dezacetoxicefalosporánsavat különíthetünk el. A termék ultraibolya adszorpciója, E}%m = =218 (260 jum-nál), fajlagos forgatása, (a)" = +148° (c = 0,5 víz). 25. példa Xanthomonas citri IFO—3835 1 napos tenyészetével 50 ml III. tápközeget inokulálunk, majd a közeget rázás közben 1 napon keresztül 28 C°-on tenyésztjük. A kapott tenyészetet 450 ml III. tápközegbe oltjuk át és a mikroorganizmusokat rázás közben 28 C°-on 1 napon át tenyésztjük. 2,5 liter fenti módon előállított tenyészettel 100 liter III. tápközeget inokulálunk, majd a közeget levegőztetés és keverés közben 24 órán keresztül 28 C°-on tartjuk. A fenti idő elteltével a sejteket centriguálással elkülönítjük, 5000 ml 0,005 M 6,0 pH-jú foszfátpuffer-oldatban szuszpendáljuk és 20 percen keresztül 10 ciklus/sec frekvenciájú ultrahanggal kezeljük. A feltárt sejteket tartalmazó elegyet dezoxiribonukleázzal, majd a proteinek eltávolítására kalcium-foszfát géllel kezeljük, végül 60%-os telítésig ammóniumszulfát-oldatot adunk hozzá. A kivált csapadékot elkülönítés után 6,8 pH-jú, 0,01 M foszfátpuffer-oldatban oldjuk, éjszakán keresztül folyóvízzel szemben dializáljuk, majd a proteinszennyeződések eltávolítására dietilaminoetil-cellulózzal kezeljük. Az oldatot liofilizálva 15 g nyers enzimet tartalmazó port állítunk elő. 3 g nyers enzimet tartalmazó port hozzáadunk 20 g D-fenilglicin-metilészter és 10 g 7-amino-3-dezacetoxicefalosporánsav 1 liter vízben készített oldatához, majd az elegyet keverés közben 1 órán keresztül 37 C°-on inkubáljuk. Az inkubálás közben az elegy pH-ját 2N nátrium-hidroxid-oldat adagolásával 6,0 értéken tartjuk. A fenti idő elteltével kapott elegyet enzimes módszerrel elemezve megállapítható, hogy az 11,3 g 6-(a-aminofenilacetamido)-3-dezacetoxicefalosporánsavat tartalmaz. A reakcióelegyet a 23. példában ismertetett módon feldolgozva 9,2 g kristályos 7-(a-amino-D-fenilacetamido)-3-dezacetoxicefalosporánsavat különíthetünk el. Ultraibolya adszorpció: E \fm = 218 (260 jum). Fajlagos forgatás: (oí)g = +148° (c = 0,5 víz). 26. példa A fentiek szerint előállított nyers enzimtartalmú port karboximetilcellulóz oszlopon kromatografálva tisztítjuk, oldószerként 0,03 M nátrium-kloridot tartalmazó 6,2 pH-jú foszfátpuffert alkalmazunk. A terméket ezután Sephadex G-75 gélszűrővel töltött oszlopon végzett gélszűréssel tisztítjuk tovább. (A „Sephadex G-75" a Pharmacia Co, Uppsala, Svédország cég által forgalomba hozott dextránvázas gélszűrő). A tisztított enzim cefalosporin-szintetizáló aktivitása kb. 80-szor nagyobb, mint a nyers enzimtartalmú poré. 13
