167924. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szubsztituált 6-[2-(1,2,4-oxadiazolil)- acetilamino]- 2,2-dimetil-penám- 3-karbonsav- és 7-[2-(1,2,3-oxadiazolil)- acetilamino]-3-metil-cef-3-ém-4-karbonsav-származékok előállítására
45 167924 46 ból a víz nyomait vákuumban benzollal távolítjuk el. A maradékot 16 órán át vákuumban foszforpentoxid felett szárítjuk. A szirupszerű terméket 35 C -on 500 ml acetonnal felkeverjük. Az acetont dekantáljuk, és ezt a műveletet még egyszer megismételjük, ekkor a maradék szilárd massza lesz. A szilárd masszát szűrőre visszük és 500-500 ml acetonnal többször felkeverjük, amíg a szűdet a vékonyréteg-kromatogram szerint célterméket már nem tartalmaz. A szűrleteket egyesítjük (összesen 4000 ml) és vákuumban kb. 300 ml térfogatra betöményítjük. Ehhez a maradékhoz 600 ml etilacetátot adunk, és a kapott oldatot kb. 250 ml végső térfogatig vákuumban ismét betöményítjük. A kapott kristályos csapadékot szívatással szűrjük, száraz etilacetáttal és széntetrakloriddal mossuk. A terméket vákuumban szárítva 41 g anyagot kapunk. A termék olvadáspontja bomlással kb. 96-98 °C. A szűrletet vákuumban bepároljuk. Az olajos maradékot kevés diklórmetánnal ismételten felkeverjük. Az így kapott szilárd anyagot szűrőre visszük és etilacetittal és széntetrakloriddal mossuk. Szárítás után a második kitermelés súlya 14,1 g. Erős bomlás közben a termék olvadáspontja 92—96 °C. A vékonyréteg-kromatogramok, az IR és PMR spektrumok szerint a két kitermelés gyakorlatilag azonos. Az összes hozam 45,1 g (kb. 55%) kb. 96% tisztaságú. IR (KBr-pasztilla, cm-1): 3440, 1745, 1720, 1600, 1430, 1390, 1320, 1240, 1220 (váll), 1180, 1070, 1040, 780, 735, 650. PMR (CDC13 és d 6 -DMSO kb. 6:1 keveréke, 60 Mc, tetrametilszilán, 6-értékek ppm-ben): 3,95 (s, 2H), 4,66 (s, 2H), kb. 7,5 (kiszélesedő s, kb. 2H). 41. példa 7-[5-etil-l,2,4-oxadiazol-3-il-acetamido]-3-[5-metil-1,3,4-tiadiazol-2-il-merkaptometil]-3-ceféni4-karbonsav-nátrium Az alkalmazott reakciókörülmények nagyjából azonosak a 34. példa szerintiekkel. 1,55 g (10 mmól) 5-etil-l,2,4-oxadiazol-3-il-acetsavból és 3,44 g (10 mmól) 7-amino-3-(5-metil-l ,3,4-tiadiazol-2-il-merkaptometil)-3-cefém-4-karbonsavból (amelynek tisztasága kb. 92%) kiindulva, 2,58 g csaknem tiszta célterméket állítunk elő. Az izolálási eljárás során a vegyületet a vízből 5,0 és 3,5 pH-értékek között végzett több etilacetátos extrakcióval távolítjuk el. Az egyesített extraktumokat 1,0 és 2,5 pH-értékeken vízzel mossuk, aktívszénnel színtelenítjük és vákuumban tökéletesen bepároljuk. A maradék só 3,2 g (kb. 65%). Ezt a terméket 65 ml aceton és 250 ml etanol keverékében feloldjuk, az oldathoz hozzáadjuk 6 mmól nátrium-aetil-kapronát etilacetáttal készített koncentrált oldatát és az így kapott oldatot vákuumban 50 ml térfogatra betöményítjük. Az erélyesen kevert oldathoz lassan 100 ml dietilétert adunk. A képződött csapadékot szívatással elkülönítjük, éterrel mossuk és vákuumban szárítjuk. _ IR (KBr-pasztilla, cm-1 ): ±3450 (H 2 0), 3280, 3050, 2985, 2940, 1765, 1680, 1610, 1580, 1550, 1415 (váll), 1390,1370. PMR (d6 -DMSO, 60 Mc, DSS, 6-értékek ppm-ben): 5 1,28 (t, J = 7,5 cps, 3H), 2,69 (s) és 2,93 (q, J = 7,5 cps) együtt 5H, kb. 3,6 (2H), 3,77 (s, 2H), kb. 4,25-4,7 (AB-q, J * 13 cps, 2H), 5,0 (d, J 4,9 cps, 1H), 5,55 (q, J * 4,9 cps, J' * 8,2 cps, 1H), 9,2 (d, J' «8,2 cps, kb. 1H). 10 42. példa A megfelelő példák szerint előállított penicillinek és cefalosporinok in vitro antibiotikus hatását vizsgáltuk agáron sorozathígítási kísérlettel és/vagy némely 15 esetben mikro-sorozathígítási kísérlettel, amelyeket a következő módon végeztünk: A) Sorozathígítási kísérlet agáron A vegyületnek 2000 Mg/ml koncentrációjú törzsoldatát készítjük el steril, megfelelő oldószerrel. Steril. 20 1/20 mólos, 6,5 pH-értékű foszfátpufferral(KH2 P0 4 NaOH) kétszeres hígításokat végzünk. Mindkét hígításból 1 ml-t steril Petricsészében levő 19 ml agy-szív infúziós agárhoz adunk. A megkeményedett felületet beoltjuk a kísérleti mikroorganizmussal és 24 25 órán át 37 C°-on inkubáljuk. B) Mikro-sorozathígítási kísérlet A vizsgált vegyület (antibiotikum) ismert koncentrációjú törzsoldatának 2 cseppjét steril Pasteur-pipettával kilenc számozott mélyedéssel ellátott vizsgáló 30 lemez első mélyedésébe cseppentjük. A pipettát fiziológiás NaCl-oldattal háromszor kiöblítjük, majd a kísérleti mikroorganizmus tenyésztőközeggel készített törzsoldatának két-két cseppjét cseppentjük a 8. mélyedés kivételével minden mélyedésbe. Az első 35 mélyedésben a vizsgált vegyület felére van hígítva. Az első mélyedésben a folyadékot keverve, ebből 2 cseppet a második mélyedésbe, majd ebből a harmadikba cseppentünk, és így tovább a nyolcadikig, s így a vizsgált vegyület oldatának hígításait geometriai sor 40 szerint kapjuk. A 9. mélyedés nem tartalmaz antibiotikumot és vakpróbaként szolgál a kísérleti mikroorganizmus szaporodásának ellenőrzésére. A vizsgáló lemezt 30 C°-on vagy 37 C°-on 18 órán 45 át inkubáljuk. Mindkét esetben a vizsgált vegyület minimális gátló koncentrációját (minimai inhibitory concentration, „MIC") adjuk meg pg/ml-ben kifejezve, ez az antibiotikumnak azon legkisebb mennyisége, amely a kísérle-50 ti mikroorganizmus szaporodását tökéletesen meggátolja. A következő táblázatok a vizsgált vegyületek és benzilpenicillin, fenoximetilpenicillin, Ampicillin, Cephalexin, Cephalotin, benzilcefalosporin, benzildez-55 acetoxi-cefalosporin mint referencia vegyületek MIC értékeit tüntetik fel. A mikro sorozathígítási kísérletekben kapott MIC értékek zárójelben vannak. Vizsgált vegyület Benzil-Cefa-PenicilPenicilAmpiCefalo-Cefadezacetlexin lin G lin V cillin sporin lotin oxicef. (sav) G (sav) (K-só) (K-só) Bacillus subtilis ATCC 6633 0,5 0,5 (0,006) (0,002) 0,03 0,09 0,12 23
