167919. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A-25822 jelű antibiotikum- komplex komponensei előállítására
15 167919 16 A Geotrichum flavo-brunneum NRRL 3862 spóraszuszpenziójával a következő összetételű ferdeagart oltjuk: Glükóz 2% Pepton 0,5% 5 KH2 P0 4 0,05% MgSO-4 0,002% FeS04 0,001% Agar 2% A tenyészeteket 7 napon át 25 °C hőmérsékleten IQ inkubáljuk, majd a felhasználásig hűtve tároljuk. A fenti tenyészetről nyert spóraszuszpenzióval 500 ml-es lombikban sterilezett 100 ml vegetatív inokulumot oltunk. A táptalaj összetétele a következő: Szacharóz 2,5% 15 Melasz 3,6% Kukoricaliszt 0,6% KH2 P0 4 0,2% Kazein* 1,0% Csapvíz 20 * Enzimesen hidrolizált kazein; Sheffield Chemical Co., Norwich, N. Y. A beoltott vegetatív tenyészetet percenkénti 250/perc fordulatszámú rázóasztalon, 25 °C 25 hőmérsékleten 24-48 órán át rázatjuk. Megfelelő növekedési szakaszban, az A 25822 jelű antibiotikumok termelésére, főfermentációs táptalajt oltunk a tenyészettel. Az inokulum térfogata előnyösen a főfermentációs táptalaj 5%-a; a főfermentációs 30 táptalaj a következő összetételű: Glükóz 2,5% Kukoricakeményítő 1,0% Pepton (hús) ' 1,0% NZ Amin A* 0,4% 35 Melasz 0,5% MgS04 • 7H 2 0 0,5% CaC03 0,2% Csapvíz * Pankreásszal hidrolizált kazein, Sheffield Chemical 40 CO., Norwich, N. Y. A táptalaj pH-ját 6,2-re állítjuk be. A fermentációt steril levegő átbuborékoltatásával 28 °C hőmérsékleten 72 órán át végezzük. A percenként átáramoltatott 45 levegő térfogata előnyösen a táptalaj térfogatának felével egyenlő. A fermentáció során a tenyészlé hatóanyagtartalmának meghatározására mintákat veszünk. A biológiai értékmérést Trichophyton mentagrophytesszel 50 végezzük, agardiffúziós módszerrel. A táptalaj pH-ja a fermentáció előrehaladtával fokozatosan 7,2-re emelkedik. A tenyészlében felhalmozódó A 25822 antibiotikumokat a következő eljárással különítjük el. 900 55 liter tenyészlevet azonos térfogatú etilacetáttal keverünk. Az emulziót szűrjük, a szűrletet szerves és vizes fázisra különítjük el. A vizes fázist elöntjük, a micéliumot 100 liter friss etilacetáttal ismét extraháljuk. A micéliumot elvetjük, a két szerves oldószeres 60 fázist egyesítjük. Az egyesített extraktumokat bepároljuk, így 50 liter vizes desztillációs maradékot kapunk. Az A 25822 jelű antibiotikumokat tartalmazó vizes oldatot desztillált vízzel 100 liter térfogatúra egészítjük ki, az oldat pH-ját 5 n nátriumhidr- 65 oxiddal 10-re állítjuk be. A lúgos pH-jú oldatot azonos térfogatú etilacetáttal kétszer extraháljuk. A vizes fázist kiontjuk. Á két etilacetátos extraktumot egyesítjük és bepároljuk, így olajos desztillációs maradékot kapunk. A desztillációs maradékot 20 liter dietiléterben oldjuk. Az oldatot kétszer, 10—10 liter 2,5 n nátriumhidroxid oldattal, majd háromszor, egyenként 10 liter hideg desztillált vízzel mossuk. A mosófolyadékot kiontjuk. A dietiléteres oldatot ezután 5 liter térfogatúra töményítjük, a koncentrátumot kétszer, 2—2 liter 0,2 n kénsavoldattal extraháljuk. A szerves fázist kiontjuk. A savas extraktumokat egyesítjük, az oldat pH-ját 5 n nátrium-hidroxid oldattal 10-re állítjuk be. A lúgos pH-jú oldatot kétszer, 5—5 liter n-hexánnal és egyszer 5 liter etilacetáttal extraháljuk. A vizes fázist elkülönítés után kiontjuk. A két n-hexános extraktumot egyesítjük és szűrjük. A szűrletet nátriumszulfáttal vízmentesítjük és csökkentett nyomáson bepároljuk, amikor desztillációs maradékként 43 g nyers A 25822 antibiotikumkeveréket kapunk. Az etilacetátos extraktumot szűrjük, a szűrletet nátrium-szulfáttal vízmentesítjük, majd csökkentett nyomáson bepároljuk, így desztillációs maradékként (hab) további 1 g A 25822 antibiotikum keveréket kapunk. A következő, 2. példában ismertetjük az egyes A 25822 antibiotikumok elkülönítését a keverékből, továbbá az elkülönített vegyületek tisztítását. Mivel az A 25822 keverékben a B komponens van jelen a legnagyobb mennyiségben a keveréket alkotó összetevők közül, a legkönnyebben ezt különíthetjük el. 2. példa Az 1. példa szerinti eljárással előállított antibiotikumkeveréket n-hexán és aceton 4:1 arányú 200 ml térfogatú elegyében oldjuk. Az oldat térfogatát nhexánnal 1 literre egészítjük ki, majd —20 °C hőmérsékletre hűtjük. Az oldatból állás közben 22,0 g A 25822 B kristályosodik ki. A kristályos B komponenst szűréssel elkülönítjük, a szűrletet bepároljuk, így szilárd halmazállapotú desztillációs maradékként 20 g A 25822 antibiotikumkeveréket kapunk. Ezt etüacetát, n-hexán és desztillált víz 80:16:4 arányú elegyének felső folyadékfázisában oldjuk. Az oldatot 13 X 63 cm méretű, bázikus alumínium-oxidból (Woelm grade W 200, Water Associates Inc., Framingham, Mass.) készült kromatografáló oszlopra engedjük. Az alumínium-oxidot etilacetát, n-hexán és víz 80:16 :4 arányú elegyének felső folyadékfázisában szuszpendálva töltjük az oszlopra. Az eluálást hasonló oldószereleggyel végezzük és 1 —1 liter térfogatú eluátumokat szedünk. Az egyes frakciókban oldott antibiotikumokat vékonyréteg-kromatográfiával azonosítjuk. A vékonyréteg-kromatográfiás analízist 20X20 cm-es, 0,25 mm vékony F 254 szilikagélen (Brinkmann Instruments, Inc., Westberry, N.Y. 11 590) végezzük. Futtatóelegyként dietiléter és etanol 3:1 arányú elegyét használjuk. Az analízist gáz-folyadék kromatográfiával is végezhetjük. Az 5. táblázatban a kromatográfiás elemzés eredményeit adjuk meg. A táblázat szerint a jelzett antibiotikumokat a jelzett egyesített eluátumok tartalmazzák. 8
