167856. lajstromszámú szabadalom • Eljárás aminopenicillinek előállítására

19 167856 20 c' = 6-(«-amino-ciklohexil-acetamido)-penicillánsav d' = 6-(a-amino-a-/4-hidroxi-fenil/-acetamido)-penicillánsav e' = 6-(«-amino-a-/3,5-diklór-4-hidroxi-fenil/-acetamido)-penicillánsav. 14. példa E példában a Biochem. Journal 115, 4, 747 (1969) cikkben ismertetett Escherichia coli N.C.I.B. 8743 mikroorganizmustörzs, illetve a találmány szerinti eljárásban felhasznált mikroorganizmustörzsek jelenlétében végzett reakciókat és azok eredményeit ismertetjük. Az Escherichia coli N.C.I.B. 8743 törzs fenilecetsavból és 6-amino-penicillánsavból penicillin G-t képez. A) kísérlet Az Escherichia coli N.C.I.B. 8743 törzs tenyésztését az idézett Biochem. Journal cikkben megadott módon végezzük. 2,5% élesztőkivonatot és 0,08% fenilecetsavat (nátriumsó formájában) tartalmazó 50 ml táptalajt Escherichia coli N.C.I.B. 8743 törzzsel oltunk be, és az elegyet 24 órán át 24 C°-on rázzuk. 400 ml így előállított tenyészethez (pH = 7,6; optikai sűrűség 600 m[x hullámhosszon: 2,80) 4 ml n-butil-acetátot adunk, és az elegyet 20 percig szobahőmérsékleten keverjük. A sejteket centrifugálással elkülönítjük, majd 20 ml 1%-os vizes n-butil-acetát oldatban szuszpendáljuk. Az idézett Biochem. Journal cikk 757—764. oldalán (elsősorban a 763. oldalon levő 9. táblázatban) megadott módon 1% 6-amino-penicillánsavat, a 9. táblázatban megadott mennyiségű D-fenilglicin-metilészter-hidrokloridot és a fenti módon előállított tenyészet optikai sűrűsége tízszeresének megfelelő koncentrációjú sejtszuszpenziót tartalmazó elegyeket készítünk, majd az elegyeket 60 percig 34 C°-on inkubáljuk. Az inkubálás során időről időre meghatározzuk a képződött a-amino-benzil-penicillin-mennyiségét. A meghatározást biológiai úton végezzük, Bacillus subtilis PCI 219 vizsgálati mikroorganizmus felhasználásával (Antibiotics and Chemotherapy 3, 50—54 (1953)]. Az eredményeket a 9. táblázatban közöljük. 9. táblázat 6-APA/D-PGME. HCl mólarány Inkubálás ideje perc Képződött a-amino-benzü-penicillin mennyisége mg/ml 1:1 15 0,09 30 0,14 45 0,31 60 0,54 1:2 15 0,10 30 ,0,28 45 0,33 60 1,00 1:4 15 0,11 30 0,29 45 0,62 60 0,98 Megjegyzés: 6-APA = 6-amino-penicillánsav D—PGME.HC1 = D-fenilglicin-metilészter-hidroklorid. A 9. táblázat adataiból leolvasható, hogy az ismert 5 módszer szerint felhasznált Escherichia coli N.C.I.B. 8743 törzs csak csekély mennyiségű (maximum 1,00 mg/ml) «-amino-benzil-penicillint termel. 10 B) kísérlet 50—50 ml „F" táptalajt (8. példa), illetve „G" táptalajt (11. példa) a 10. táblázatban felsorolt mikroorganizmusokkal oltunk be, és az elegyet 18 órán át 28 C°-on 15 rázzuk. Az egyes tenyészetekből centrifugálással különítjük el a sejteket. 0,5% 6-amino-penicillánsavat, 1,0% D-fenilglicin-metilészter-hidrokloridot és a 0,1 mólos citrát-foszfát-20 -pufferoldatban (pH = 5,5) előállított tenyészet optikai sűrűségének ötszörösét kitevő mennyiségű mikroorganizmus-sejtet tartalmazó elegyeket készítünk, és az elegyeket 60 percig 37 C°-on inkubáljuk. Az inkubálás során időről időre meghatározzuk a képződött a-amino-benzil-penicillin mennyiségét. A meghatározást az Antibiotics and Chemotherapy 3, 50—54 (1953) szakcikkben ismertetett biológiai módszerrel végezzük, az A. kísérletben ismertetettel azonosan. Az eredményeket a 10. táblázatban ismertetjük. 10. táblázat Mikroorganizmus Tenyésztés közege Inkubálás ideje perc Képződött a-amino-benzil-penicillin mennyisége, mg/ml Acetobacter sp. G 15 3,03 IFO 13209 30 4,75 45 4,38 60 4,75 Mycoplana di-G 15 2,38 morpha IFO 30 2,95 13213 45 3,45 60 4,10 Protaminobacter G 15 0,39 alboflavus IFO 30 1,18 13221 45 1,75 60 1,93 Xanthomonas F 15 1,75 citri IFO 30 3,23 3781 45 2,18 60 1,75 Acetobacter G 15 1,41 turbidans 30 3,23 IFO 3225 45 3,55 60 3,95 60 A 10. táblázat és a 9. táblázat adatainak összevetéséből megállapítható, hogy a találmány szerinti eljárásban felhasznált mikroorganizmusok még 0,5-szeres sejtkoncentrációban is lényegesen több «-amino-benzil-penicillint termelnek az ismert eljárás szerint felhasznált 65 mikroorganizmusnál. 10