167843. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új szindnonszármazékok előállítására
> 5 0,6 mg, 0,05 ml 2% digitonint tartalmazó paraffinolajban szuszpendált, száraz, hővel elölt Mycobacterium butyricumot fecskendeztünk, majd a vegyület előírt adagját (kezdetben 5 mg) 0,2 ml kukoricacsíra-olajban vagy 20 ml 0,85%-os vizes nátriumklorid-oldat és 1 csepp poliszorbát-80 elegyében mint hordozóban oldva vagy szuszpendálva a gyomorba vagy szubkután beadtuk. Az ilyen beadást további 18 napig naponta megismételtük. A kontrollcsoportnak azonos módon, egyidőben egymagában adtuk a vivőanyagot. A 20. napon leöltük a patkányokat, és megmértük mindegyik hátsó mancspár teljes térfogatát önkényes egységekben. Egy vegyületet gyulladásmérséklő hatásúnak tekintünk, ha a kezelt csoportban levő hátsó mancsok átlagos térfogata szignifikánsan (P <[ 0,05) kisebb a kontrollcsoport megfelelő értékénél. Az első és harmadik vizsgálat alapján a 3-[2-(fenil-tio) -etil] -szidnon 1 mg mennyiségben a gyomorba adva, a második vizsgálat alapján 10 mg szubkután beadva bizonyult hatásosnak. Az új vegyületek antibiotikus hatása a következő vizsgálati módszerekkel mutatható ki. Az antibakteriális hatás nyilvánvaló ama vizsgálatak alapján, amelyekben a táphúslét kétszer, a gyártó cég (Difco) által javasolt koncentráció kétszeresében sterilizálva és 2tf% Bacillus subtilis vagy Erwinia sp. tenyészettel beoltva kezelünk. Eközben a vegyületet steril desztillált vízben, 2000 \ig/m\ koncentrációban, 80 C°-on 20 percig melegítettük. Ennek a készítménynek és azonos térfogatú beoltott húslének az elegyét aerób 37 C°-on inkubáltuk, majd vizuálisan megfigyeltük a próba-mikroorganizmus növekedését. Az inkubációs időtartam 20-24 óra volt B. subtilis és 24-48 óra Erwinia sp. esetében. Ha a mikroorganizmus növekedése észlelhető, a vegyületet hatástalannak tekintjük. Ha nem tapasztaltunk ilyen növekedést, a kitenyésztett keveréket sorozatosan hígítottuk, és az előzővel azonos összetételű, fele töménységű táptalajjal, amely 2% helyett csak ltf% sejtkultúrát tartalmaz, oltottuk be. Az utóbbi táptalajt úgy adagoltuk, hogy a vegyület koncentrációja 100, 10 és 1 u,g/ml legyen. Az így kapott keverékeket az előzőhöz hasonlóan kitenyésztettük, és vizuálisan megvizsgáltuk a próbaszervezet növekedését. A hatást azzal a minimális töménységgel fejezzük ki, amelynél a próbaszervezet növekedése nem észlelhető. Az előzővel azonos hatóanyagot nem tartalmazó tenyészetek szolgálnak kontroll gyanánt. Az új vegyületek gombaölő hatása kitűnik standard vizsgálatok alapján, amelyekben kétféle koncentrációban készítettünk Sabouraud-féle glukózagart (gyártó cég: Baltimore Biological Laboratories vagy Difco),- az egyik a gyártó cég által ajánlott, a másik annak kétszerese. Ezeket a készítményeket sterilizáltuk, majd 80 C°-on folyékony állapotban tartottuk őket. Eközben a vizsgált vegyületet steril desztillált vízben 2000 |xg/ml töménységben, 80 C°on 20 percig melegítettük. Ennek a vegyületkészítménynek a kétszeres erősségű agárral azonos térfogatú keverékét sorozatosan hígítottuk, és a vizsgálandó vegyületet 1000, 100, 10 és 1 ng/ml koncentrációban tartalmazó egyszeres erősségű agárral kevertük. Az így kapott keverékeket lehűlni és meg-6 dermedni hagytuk, majd Trichophyton mentagrophytes, C. albicans, Fusarium sp. vagy Verticillium alboatrum szuszpenziójával beoltottuk, és levegőn szobahőmérsékleten inkubáltuk. Az inkubálás időtarta-5 ma Trichophyton mentagrophytes esetében 6-7 nap, C. albicansnál 48 óra, Fusarium sp. és Verticillium alboatrum esetében 5-7 nap volt. Az aktivitást vizuálisan állapítottuk meg, a hatékonyságot azzal a legkisebb koncentrációval fejeztük ki, amelynél a 10 próbaszervezet növekedése már nem észlelhető. Az előzővel azonos, hatóanyagot nem tartalmazó tenyészetek szolgáltak kontroll gyanánt. Az új vegyületek algaölő hatása kitűnik a Chlo-15 rella vulgaris növekedését gátló képességük vizsgálatából. Ebben a próbában 0,25 g nátriumnitrátot, 0,025 g kalciumkloridot, 0,175 g káliumdihidrogénfoszfátot, 0,075 g dikáliumhidrogénfoszfátot, 0,075 g magnéziumszulfátot, 0,025 g nátriumkloridot, 0,005 20 g vas (III) kloridot, 3,0 g élesztőkivonatot és 10,0 ml talajkivonatot, valamint 500 ml térfogatra való feltöltéshez elegendő desztillált vizet tartalmazó tápanyagot sterilizáltunk, és beoltottuk 2tf% sterilen tartott Chlorella vulgaris tenyészettel. (A talajkivo-25 natot úgy készítettük, hogy a talaj és a desztillált víz keverékét sterilizáltuk, és eltávolítottuk belőle az oldhatatlan részeket.) Eközben a vegyületet 2000 ug/ml töménységű steril desztillált vizes oldatban 20 percig 80 C°-on melegítettük. A beoltott közeg és 30 a vegyület oldata azonos térfogatainak elegyét szobahőmérsékleten, aerób módon, állandóan megvilágítva 4-7 napig inkubáltuk, majd vizuálisan vizsgáltuk a próbaszervezet növekedését. Ha növekedés észlelhető, a vegyület hatástalannak tekinthető. Ha 35 nem volt növekedés, a kitenyésztett keveréket sorozatosan hígítva, az előzőkben leírt összetételű, de 500 ml helyett 1000 ml-re feltöltött és 2tf% helyett ltf%-os beoltott közeggel kevertük. Az utóbbi közeg mennyiségét úgy választottuk meg, hogy 100, 10 40 és 1 [xg/ml koncentrációértékeket kapjunk. A kapott keverékeket az előbbi módon inkubáltuk, és vizuálisan vizsgáltuk a próbaszervezet növekedését. A hatékonyságot azzal a legkisebb koncentrációval fejeztük ki, amelynél a próbaszervezet növekedése már 45 nem észlelhető. Az előzővel azonos, de vizsgált vegyületet nem tartalmazó tenyészetek szolgáltak kontroll gyanánt. A szakember számára nyilvánvaló, hogy a hatékonyság bizonyos biológiai hatásokra vonatkozó 50 próbák útján való megfigyelése alapvető jelentőségű értékes új állati és emberi gyógyszerek kifejlesztése szempontjából. Ilyen alkalmazásokon kívül a moszatok ellen hatásos vegyületeket kazántápvíz kezelésére és hasonló célokra lehet felhasználni. 55 Az alábbi példák részleteiben világítják meg a találmány szerinti eljárást. A hőmérsékleti adatok Celsius-fokban és a relatív anyagmennyiségek általában súlyrészben értendők. A súlyrész és térfogatrész kö-60 zötti összefüggés azonos a gramm és milliliter viszonyával. Az infravörös maximumokat kloroformos oldatban mértük és reciprok centiméterekben (cm-1 ) adjuk meg. Az ultraibolya maximumokat ls%-os kloroformos oldatban, szobahőmérsékleten határoz-65 tuk meg, és nanométerekben (nm) értendők. 3
