167714. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glicerinkináz kinyerésére mikroorganizmusokból

5 167714 6 koncentrációig ammóniumszulfátot adunk, mikoris a glicerin-kináz kikristályosodik. A kitermelés 8 g, a fajlagos aktivitás 83 egység/mg. 2. példa (összehasonlító kísérlet) Összehasonlító kísérletet végzünk annak bemutatására, hogy milyen fontos az eljárási lépéseknél a találmány szerinti kombinációs sorrend. A következőket hasonlít- 10 juk össze: 1. a találmány szerinti eljárást, 2. az 1 238 422 sz. DAS-ban leírt eljárást, 3. az előző eljárást protaminszulfátos lépéssel módosítva, 15 4. az előző eljárást DEAE-Sephadex alkalmazásával módosítva, 5. a találmányéhoz hasonló munkamenetet használva, de elhagyva a protaminszulfátos kezelés utáni DEAE-Sephadexes lépést. 20 A kísérletnél ugyanolyan módon dolgozunk, ahogy azt az 1. példában, illetve az 1 238 422 sz. DAS-ban leírtuk. Az 1. és 2. kísérletnél 500 g Candida-ból, a 3. kísérletnél 40 g Candida-ból és a 4. kísérletnél 107 g Candidaból indultunk ki. 25 A találmány szerinti munkamódszerrel dolgozva a kitermelés 58%-os volt. Ennek megfelelően 300 g Candida-ból 330 mg enzimkészítményt kaptunk, mely mgonként 95 egységet tartalmaz. A készítmény nem bomlik, a kristályosítás előtti vizes oldatot 10 napon keresztül 0 C°-on tartva az aktivitás 100%-os maradt. A 2. kísérletnél a kitermelés 8,8%-os volt. 300 g Candida-ból kiindulva az enzimkitermelés 48 mg volt, aktivitása mg-onként 95 egység. A találmány szerinti eljárás alkalmazásával tehát 690%-kal nagyobb kitermelés érhető el. Ha a 2. kísérletben kapott oldatot 0 C° hőmérsékleten 10 napon keresztül tároljuk, az teljesen inaktívvá válik. A 3. kísérletnél 5,2%-os kitermelést értünk el, tehát 300 g Candida-ra számolva a kitermelés 23,8 mg. E kísérletnél a protaminszulfátos lépés beiktatása sem javította a kitermelést. A 4. kísérletnél 22%-os kitermelést értünk el. 300 g Candida-ra számolva ez a kitermelés 100 mg súlyú, mgonként 95 egységet tartalmazó készítménynek felel meg. A 2. és 3. kísérletek kitermelésével összehasonlítva tehát a kitermelés lényegesen megjavult. Az 5. kísérletnél az eljárást egészen a dialízisig végeztük. Kimutatható, hogy az anioncserélő gyantával való kezelés elhagyása egyedül a dialízisnél 34%-os aktivitáscsökkenést okoz, ha egyébként a találmány szerinti eljárással dolgozunk. Az összehasonlító kísérletek egyes részleteiről a következő táblázat közöl adatokat. A táblázatban megadjuk az összehasonlító kísérletek minden lépésének jellemző adatait, a térfogatokat, az aktivitást és a kitermelést. /. táblázat 1. Lépés ml Aktivitás lés. % Megjegyzés Nagynyomású diszpergálás extraktuma 9000 5,45 • 104 100 a találmány szerint Protaminszulfátos oldat 8700 5,02 • 104 93 DEAE-Sephadex-es eluátum 1340 3,9 • 104 72 Oldat a 60 C°-os hőkezelés után 1280 3,07 • 104 57 2,05 mólos ammóniumszulfátos oldat 112 2,80 • 104 52 Dializátum 65 3,54 • 104 65 Eluátum DEAE-Sephadex-ről 285 3,11 • 104 58 2. Lépés ml Aktivitás lés, % Megjegyzés Erjesztéses feltárás extraktuma 3280 4,7 • 104 100 az 1 238 422 sz. DAS szerint Oldat 60 C°-os hőkezelés után 3280 1,71 • 104 36 2,05 mólos ammóniumszulfátos oldat 205 1,05 • 104 22 Dializátum 164 1,01 • 10* 21 Eluátum DEAE-Spehadex-ről 470 0,41 • 104 8,8 3. Lépés mt Aktivitás 1 lés,% Megjegyzés Protaminszulfátos oldat az erjesztéses feltárás az 1 238 422 sz. DAS szerint + után 1000 5,6 • 103 100 protaminszulfátos lépés Oldat 60 C°-os kezelés után 1000 1,7 • 103 30 Ammóniumszulfátos csapadék feloldva 20 5,06 • 102 9,1 Dializátum 22 3,86 • 102 6,9 A kitermelések a protaminszulfátos oldatra vonatkoznak Eluátum DEAE-Sephadex-ről 250 2,9 • 102 5,2