167714. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glicerinkináz kinyerésére mikroorganizmusokból
MAGYAR NÉPKÖZTÁRSASÁG ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL SZABADALMI LEÍRÁS Bejelentés napja: 1970. IX. 09. (BO—1247) Német szövetségi köztársaságbeli elsőbbsége: 1969. IX. 11. (P 19 46 137.1) Közzététel napja: 1975. VII. 28. Megjelent: 1976. XII. 31. 167714 Nemzetközi osztályozás: C 07 g 7/028 Feltalálók: Bergmeyer Hans Ulrich vegyész Naher Gotthilf gyógyszerész, Thum Waldemar vegyész, Lauerer Albert vegyész, Emmer Rudolf vegyész, Tutzing, Német Szövetségi Köztársaság Tulajdonos: Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Német Szövetségi Köztársaság Eljárás glicerinkináz kinyerésére mikroorganizmusokból i A találmány tárgya új eljárás glicerinkináz kinyerésére glicerinkinázt termelő mikroorganizmusokból, mely ipari méretekben való megvalósításra is alkalmas. Az 1 238 422 sz. német szövetségi köztársaságbeli közzétételi irat eljárást ismertet a glicerinkináz előállítá- 5 sara, mely szerint bizonyos mikroorganizmusokat liofilizálnak, a liofilizátumból 37 °C-on való erjesztéssel extraktumot készítenek, ezt hőkezelik, ammóniumszulfáttal első ízben frakcionálják, dializálják, anioncserélő gyantával kromatografálják, végül másod- 10 szór is frakcionálják ammóniumszulfáttal. Az eljárás hátránya az, hogy gyakran csak nagy veszteségekkel hajtható végre. Megállapították azt is, hogy néha a felhasznált mikroorganizmusok annyira megváltoznak, hogy az eljárás többé nem vezet eredményre. 15 Ismeretes olyan eljárás is, melynél Escherichia coli-törzsekből ultrahangos feltárással extraktumot állítanak elő, ezt sztreptomicinnel kicsapják, hőkezelik, ammóniumszulfáttal frakcionálják, dializálják, ammóniumszulfáttal másodszor frakcionálják és végül DEAE-cellu- 20 lózon kromatografálják. Ez az eljárás gyenge kitermelést ad, kb. 30%-osat és más mikroorganizmusok esetén nem is használható. Szükség volt olyan iparilag is használható eljárásra, mely az eddig ismert eljárásoknál jobb kitermelést ad és 25 megbízhatóan reprodukálható. A találmány szerinti eljárás kidolgozásánál abból a feltevésből indultunk ki, hogy az említett közzétételi iratban leírt eljárásnál fellépő, tisztázatlan eredetű veszteségek a proteázok hatására vezethetők vissza. Olyan el- 30 járást dolgoztunk ki, melynél az egyes lépések megfelelő megválasztásával kiküszöböltük a kívánt enzim proteolitikus megbontásának lehetőségét. A találmány szerinti eljárásnál a glicerinkinázt mikroorganizmusokból állítjuk elő. Az eljárás kivitelénél az adott esetben megszárított mikroorganizmusokat nagynyomású diszpergálással feltárjuk, ezt követően protaminszulfáttal kicsapjuk, a csapadékot elkülönítjük, a szüredéket ismert módon cellulóz vagy dextrán-alapú anioncserélő gyantával kezeljük. A találmány szerinti eljárással jó kitermeléssel állíthatunk elő olyan preparátumot, mely állandó és az ismert eljárásokkal tovább tisztítható. Mikroorganizmusként célszerűen Candida mycoderma-törzset alkalmazunk. Más mikroorganizmusokból is ki lehet indulni, ha glicerin-kináz-tartalmuk alapján feldolgozásuk gazdaságosnak mutatkozik. A mikroorganizmusokat friss vagy fagyasztott állapotban használjuk fel. Kiindulhatunk fagyasztással víztelenített anyagból is. Ez esetben puffert alkalmazunk és olyan pasztát készítünk, melynek töménysége ugyanolyan, mint a frissen előállított sejt-pasztáé. A sejtszuszpenziót önmagában ismert módon nagynyomású diszpergálással tárjuk fel. Ily módon olyan enzimszuszpenzió keletkezik, melynek szilárdanyag-tartalma ml-enként célszerűen 20 és 40 mg között van. Esetleg megfelelő mennyiségű vizet is adagolunk a feltárás előtt vagy után. A keletkezett enzim-szuszpenziót protaminszulfát-oldattal keverjük össze 6 és 8 közötti pH-értéken. Ha 167714 1
