167655. lajstromszámú szabadalom • Eljárás N-terminálisán alfa-aminooxikarbonsavat tartalmazó, új, ACTH hatású polipeptidek előállítására
25 167655 26 számított: C 60,0%; H 7,7%; N 11,1%; talált: C 59,5%; H 7,9%; N 11,4%. juk. 0,554 g (89%) védett nonadekapeptidamid-hidrokloridot kapunk. R3f = 0,68. 2. lépés H-Lys(BOC)-NH2 .oxalát 100 ml metanolban feloldunk 5,0 g (13,2 mmol) Z-Lys(BOC>NH2-t és 2,0 (22,2 mmól) vízmentes oxálsavat, majd 1,0 g 10%-os csontszenes palládium katalizátor jelenlétében hidrogénezzük. A reakció befejeződése után a katalizátort kiszűrjük, az oldatot bepároljuk és a maradékot éterrel eldörzsöljük. Szűrés, éteres mosás, szárítás után 4,3 g (97%) H-Lys (BOC)-NH2 oxalátot kapunk. Op.: 165-166 C°. Elemzés a Ci 3 H 2s N 3 0 7 összegképlet alapján: számított: C 46,6%; H 7,5%; N 12,5%; talált: C 46,9%: H 7,2%; N 12,3%. 3 lépés: Z-Lys(BOC)-Lys(BOC} (BOC)-NH2 Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys 3,24 g (3,0 mmól) Z-Lys(BOC)-Lys(BOC) -Lys(BOC>Lys(BOC)N2 H 3 -ot feloldunk 15 ml dimetilformamidban. A -20 C°-ra hűtött oldatba keverés közben becsepegetünk 3 ml (12 mmól) 4 n etilacetátos sósav-oldatot, majd 0,43 ml (3,6 mmól) terc-butilnitritet. A reakcióelegyet 5 percig -10 C°-on tartjuk, majd —20 C°-ra hűtjük és hozzáadjuk 1,18 g (3,5 mmól) H-Lys(BOC)-NH2 oxalát és 2,66 ml (15 mmól) diizopropiletilamin 10 ml dimetilformamidos oldatát. A reakcióelegyet 2 órán át -5 és 0 C° közötti hőmérsékleten, majd másnapig 0 C°-on tartjuk. Ezután az oldatot bepároljuk, a maradékot vízzel eldörzsöljük, szűrjük, vízzel mossuk. A nyers terméket metanol-víz 1:1 arányú elegyéből átkristályosítiuk. 2,85 g (75%) Z-Lys(BOC>Lys(BOC) -Lys(BOC) -Lys(BOC) -Lys(BOC>NH2 -t kapunk. Op.: 209-211 C°Rf =0,73 4. lépési H-Lys(BOC) Lvs(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOc! Lys(BOC)-NHa 2,6 g (2,04 mmól) Z-Lys(BOC>Lys (BOC)-Lys(BOC) -Lys(BOC>Lys(BOC>NH2 -t 75 ml metanolban feloldunk és 0,5 g 10%-os csontszenes palládium katalizátor jelenlétében hidrogénezzük. A reakció befejeződése után a katalizátort kiszűrjük, az oldatot bepároljuk és a maradék éterrel eldörzsöljük. 2,0 g (86%) H-Lys(BOC) -Lys(BOC>Lys(BOC>Lys (BOC) -Lys-(BOC>NH2 -t kapunk. R f r = 0,47. 5. lépés: BOC-D-OSer-Tyr-Ser- Met-GMOBu^-His-Phe -Arg-Trp-Gly-Lys(BOC) -Pro-Val-Gly-Lys(BOC) -Lys (BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC).HCI 0,398 g (0,20 mmól) BOC-D-OSer-Tyr-Ser -Met-GluODBu^His-Phe -Arg-Trp-Gly-Lys(BOC) -Pro-Val-Gly-OH.Hcl-ot, 0,228 g (0,20 mmól) H-Lys(BOC> Lys(BOC) -Lys(BOC>Lys(BOC>Lys(BOC)-NH2 -t és 0,166 g (0,90 mmól) pentafluorfenolt 3 ml dimetilformamidban feloldunk és 0,063 g (0,30 mmól) DCC-t adunk hozzá. A teakcióelegyet 16 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd a DCU-t kiszűrjük és a szűrletet éterrel hígítjuk. A kivált terméket szűrjük, éterrel mossuk, vákuumban szárít-9. példa 5 H-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-D-Lys-NH2 0,400 g (0,128 mmól) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met 10 -GluíOBut-His-Phe-Arg -Trp-Gly-Lys(BOC) -Pro-Val-Gly-Lys(BOC) -Lys(BOC)-Lys(BOC) -Lys(BOC)-DLys(BOC}-NH2 .HCl-ot 3,2 ml trifluorecetsav, 0,4 ml anizol és 0,4 ml víz elegyében oldunk. Az oldatot 1 óra után 80 ml éterrel hígítjuk és a kivált csapadékot 15 leszűrjük. A nyers nonadekapeptidamid-trifluoracetátot 10 ml vízben oldjuk és a Whatman CM-52 ioncserélőből készített 3,5x53 cm-es oszlopon 1,5 liter 0,2 mól (pH 6,7) és 1,5 liter 0,6 mól (pH 6,7) ammóniumacetát pufferből készített lineáris puffer-20 gradienssel kromatografáljuk. A terméket tartalmazó 95—110. frakciókat összegyűjtjük és liofilizáljuk. 0,132 g (31%) aminooxikarbonsawal helyettesített nonadekapeptidamidot kapunk. R| = 0,16; peptid tartalom: 70,3%; metionin-szulfoxid tartalom: 1,4%; 25 Tyr/Trp arány: l,05;aminosavanalízis:Lys 6,4 (6),His 1,0(1), Arg 1,0(1), Ser 0,85(1), Glu 0.9(1), Pro 1,0(1), Gly 2,0(2), Val 1,05(1), Met 0,95(1), Tyr 0,1(1), Phe 1,1(1). A kiinduló anyagként használt védett, aminooxi-30 karbonsavval helyettesített nonadekapeptidamid-hidrokloridot az alábbi módszerrel készítjük: 1. lépés: Z-D-Lys(BOC)-NH2 35 5,6 g (10 mmól) Z-D-Lys(BOC)-OH.diciklohexil amin sót 100 ml éterrel és 50 ml n kénsawal oldódásig rázunk. Az éteres oldatot 25 ml vízzel mossuk, majd szárítás után bepároljuk. A maradékot 4Q 60 ml vízmentes tetrahidrofuránban oldjuk, 1,4 ml (10 mmól) trietilamint adunk hozzá, majd keverés közben -10 és -20 C° közötti hőmérsékleten 1,3 ml (10 mmól) klórszénsavizobutÜésztert csepegtetünk a reakcióelegyhez. Ezután 10 percig -10 C -on tartjuk, 45 majd -10 C° alatti hőmérsékleten 3,75 ml (50 mmól) tömény ammóniumhidroxid-oldatot csepegtetünk bele. A keverést még 2 órát folytatjuk, a reakcióelegy hőmérsékletét közben 0 és 5 C° között tartjuk. A tetrahidrofuránt ezután ledesztilláljuk és a maradékot 50 90 ml etilacetátban feloldjuk. Az oldatot kétszer 20 ml n sósavval és kétszer 20 ml 8%-os nátriumhidrogénkarbonát oldattal mossuk, szárítás után bepároljuk és a maradékot éterrel eldörzsöljük. Szűrés, szárítás után 3,1 g (82%) Z-Lys(BOC>NH2 -t kapunk. Op.: 55 139-140 C°. Elemzés a Ci 9 H 2 9 N 3 0 5 összegképlet alapján: - számított: C 60,0%; H 7,7%; NI 1,1%; talált: C 60,4%; H 7,8%; N 11,0%. 60 2. lépés: H-D-Lys(BOC)-NH2 .oxalát 75 ml metanolban feloldunk 2,6 g (6,9 mmóli Z-D-Lys(BOC>NH2 -t és 1,04 g (10,6 mmól) vízmen-65 tes oxálsavat, majd 0,5 g 10%-os csontszenes palládium katalizátor jelenlétében hidrogénezzük. A reakció befejeződése után a katalizátort kiszűrjük, az oldatot 13
