167616. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vírusellenes hatású komplex előállítására

19 167616 20 <£ példa Az 1. példa szerinti módon lefolytatott fermentációt a 28. napon megszakítjuk, a fermentlevet leszűrjük és a kapott 70 liter szűrletet 2 x 14 liter kloroformmal extraháljuk. Az egyesített kloroformos kivonatot vízmentes nátrium-szulfáttal szárítjuk és csökkentett nyomáson bepároljuk. Ily módon maradékként a nyers komplex vírusellenes hatóanyagot kapjuk. Toluol, metanol, kloroform és víz 9:9:4:4 térfogatarányú elegyét összerázzuk és így egy felső és egy alsó fázisból álló kétfázisú oldószer-rendszert kapunk. A fenti módon kapott 15 g komplex vírusellenes hatóanyagot az alsó fázis 300 ml-ében oldjuk, majd ezt az oldatot és ezt követően az alsó fázis további két 300 ml-nyi adagját a felső fázis 100-100 ml-nyi részével kétszer kirázzuk. Az alsó fázisokat egyesítjük, a kapott 900 ml oldatot szárazra pároljuk és a maradékot az alább leírt módon dolgozzuk fel tovább. Ujabb kétfázisú oldószer-rendszert készítünk, 60—80 °C forráspont-tartományú petroléter, toluol, -metanol és víz 2:3:4:1 térfogatarányban történő összerázása útján; az így kapott alsó fázis 100 ml-jében oldjuk a fenti bepárlási maradékot. Ezt az oldatot, valamint az utóbb leírt kétfázisú oldószerrendszer alsó fázisának 100 ml-jét külön-külön kétszer kirázzuk a felső fázis 100-100 ml-jével, majd az alsó fázisokat egyesítjük és a kapott 200 ml oldatot szárazra pároljuk. 10 g maradékot kapunk, ezt 850 g dezaktivált szilikagélen kromatografáljuk. A dezaktivált szilikagélt oly módon készítjük, hogy a szilikagélhez 250 g-os részletekben 30—30 ml vizet adunk és az így megnedvesített szilikagél-adagokat egy lezárt csavarosfedelű edényben egy forgómalomban való forgatás útján alaposan összekeverjük. A kapott eluátum-frakciókat többszörös preparatív vékonyréteg-kromatográfiával („G.F." szüikagéllemezen) tisztítjuk tovább; mindegyik kromatografálási művelet után a megfelelő anyag-részt elkülönítjük a szokásos módon a lemezről és egy további lemezen újabb kromatografálásnak vetjük alá. Az ilyen módon végzett kromatográfiai tisztítás és szétválasztás eredményeit az alábbi táblázatban foglaltuk össze: Jegyzetek a táblázathoz: Az oldószer-rendszerek összetétele: a toluol — etilacetát 1:2 b kloroform — metanol — hangyasav 95:4:1 c kloroform — etilacetát 1:1 5 d kloroform — metanol 95:5 x) 10 xx) 15 Ha a végső tisztítási műveletben a b oldószer-rendszert alkalmazzuk, mint a jelen esetben, akkor ez meggátolja, hogy a kromatografálás folyamán a C-szirodezmin diszproporcionálódási reakció útján A- és B-szirodezmin elegyévé alakuljon át. 225 g dezaktivált szilikagélt tartalmazó oszlopon tisztítva, futtatószer: kloroform. 20 9. példa 11 g tisztított komplex vírusellenes szert — amelyet a 8. példában leírt módon állítottunk elő, oldószeres megoszlatással - 30 ml piridinben oldunk és ehhez hozzáadunk egy olyan hideg piridines kén-dioxid-oldatot, amelyet úgy állítottunk elő, hogy 51 ml piridinen keresztül kén-dioxidot • buborékolta-25 tunk mindaddig, míg az oldat térfogatáéi nem éri a 62 ml-t. Az elegyet fél óra hosszat szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd jégre öntjük és a kapott vizes elegy pfi-értékét 410 ml 2 n sósavoldat hozzáadása útján 2-re állítjuk. A savas vizes elegyet kloroformmal 30 extraháljuk, a kloroformos kivonatot elkülönítjük, vízzel mossuk, szárítjuk és bepároljuk. 8,9 g maradékot kapunk, ezt dezaktivált szilikagélen kromatografáljuk; az alábbi eredményeket kapjuk: 35 Oldószer-rendszer 40 45 % etilacetát tf. Frakció-súli sz. toluolban liter g 1. 40 1,1 2. 40 1,6 1,2 3. 40 0,5 5. 40 0,9, 0,88 5. 40 1,1-2,5 6. 70 1,6; Vékonyréteg Elkülönített vegyület Oszlop-kromatográfia kromatográfia . % Oldószerfrak- étű- rendsz. cio acetát szamtolulban ^ ti. liter Oldószerrendszer 1. 20 4,5 2. 30 2,0 3. 30 1,7 a,b G-szirodezmin 4. 40 3,6 b,b,b,c b,b,b,b,c,c,b,c b,a,b F-szirodezmin E-szirodezmin D-szirodezmin 5. 40 1,0 b,a H-szirodezmin 6. 50 1,4 b A-szirodezmin 7. 50 5,0 d,b x

> A-szirodezmin d,b x

> C-szirodezmin 8. 50 1.4 9. 100 1,8 XX) 10. 100 5,6 XX) B-szirodezmin A 2. frakciót preparatív vékonyréteg-kromatográfiával tisztítottuk, „G.F." szilikagél-lemezen; elő-50 szőr kloroform - metanol - hangyasav 95:4:1 oldószer-rendszert alkalmaztunk 0,4 és ennél nagyobb Rf-értékű frakcióknak a 0,4-nél kisebb Rf-értékű frakcióktól való elkülönítése céljából. A 0,4-nél kisebb Rf-értékű frakciókat ugyancsak 55 preparatív vékonyréteg-kromatográfiával tisztítottuk tovább, etilacetát és kloroform 7:3 arányú x elegyével; ily módon J-szirodezmint kaptunk. A 0,4 és ennél nagyobb Rf-értékű frakciókat szintén preparatív vékonyréteg-kromatográfiával tisz-60 títottuk tovább, oldószer-rendszerként kloroform, metanol és hangyasav 95:4:1 arányú elegyét, majd ezt követően toluol és etilacetát 1:2 arányú elegyét alkalmaztuk és így J-szirodezmint kaptunk. Az 5. és 6. frakciót egyesítettük és 288 g 65 dezaktivált szilikagélt tartalmazó oszlopon kromatografáltuk kloroformmal; ezekből a frakciókból ily módon A-szirodezmint kaptunk. 10