167411. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vízoldhatatlan fehérje-készítmények előállítására

7 167411 8 A szakirodalomban ismertetett más gyantára érvényes tapasztalatokkal ellentétben - ahol a reakciót pufferrel tompított oldatokban végzik - a fent leírt gyantákon rögzített és enzimekben kifejezett hozam annál magasabbnak bizonyult, minél kisebb volt az oldat sótartalma. A megkötött anyag pl. fehérje, illetve peptid súlyaránya a hordozógyantához tág határok között változtatható és a későbbi felhasználási célnak megfelelően beállítható. Jó hozamokat értünk el, ha 1 súlyrész fehérjére számítva 4-10 súlyrész polimer hordozóanyagot alkalmazunk. Az optimális súlyviszonyok azonban mind a polimerek összetételétől és szerkezetétől, mind a fehérjék minőségétől is függnek. Számos enzimnél célszerűnek bizonyult, ha az enzimoldathoz stabilizátorokat adagolunk. Stabilizátorként polietilénglikolok vagy nem ionos nedvesítőszerek jönnek számításba a felület denaturálódásának csökkentése céljából, valamint az ismert SH-reagensek vagy speciális enzimeknél a fémionok. * A szükséges reakcióidő a polimerek jellegétől függ. Normál esetben a reakció 20 óra leforgása alatt szobahőmérsékleten befejeződik. 4 C°-on a reakció jobban megy végbe, de hosszabb időt vesz igénybe. A preparatív adagok előállításánál a reakciót a lúg hozzáadás befejezése után legfeljebb 2 óra múlva szakítjuk meg pH szabályzószerkezet segítségével. Ezután a megkötött fehérjét tartalmazó polimereket leszívatjuk vagy lecentrifugázzuk és a maradékot nagy ionerősségű sóoldatokkal pl. 1 mólos nátriumkloriddal, végül pufferoldattal mossuk, amelyben az enzim stabilan megmarad. A nagy sókoncentrációjú oldatokkal való mosásnál az ionogén módon megkötött fehérjét a hordozóról leoldjuk. A fehérje megkötés eredményességének megítélése szempontjából az enzimeknél meghatároztuk az enzimatikus aktivitást, mind a polimereken, mind a maradékoldatban és a mosóvizekben. A specifikus hatás nélküli fehérjéknél a polimerekben Kjeldahl szerint a nitrogéntartalmat határozzuk meg. A fehérje rögzítésénél elérhető hozam 10 és 90% között van. Ha az enzimatikus aktivitást tekintjük, akkor egyes esetekben előnyös az, ha a polimer anyagokból túl nagy felesleget nem alkalmazunk, ezzel ugyan a fehérje teljes mértékben rögzíthető, annak hatékonysága azonban csökken. A hordozógyanták minden olyan anyag rögzítésére alkalmasak, amelyek a polimerekben levő anhidrid csoportokkal szemben reakcióképes funkciós csoportokat tartalmaznak. Ilyen csoportok a fehérjék és peptidek esetében mindenekelőtt a lizin véghelyzetű amino-csoportjai és a peptid-láncvégek szabad amino-csoportjai. A hordozón megkötött peptidek és fehérjék nagy tudományos és műszaki jelentőséggel rendelkeznek. A legtöbb esetben költséges és instabil enzimeket a gyantán való rögzítés jelentős módon stabilizálja. Ezenkívül a gyantán rögzített enzim könnyű és teljes mértékű visszanyerése lehetővé teszi az enzimek sokoldalú felhasználását hosszú időtartamon keresztül. A találmány szerinti kopolimereken rögzíthető anyagok pl. a következők: Enzimek: hidrolázok, mint proteáz, pl. tripszin, 5 kimotripszin, papain, elasztáz, amidázok, pl. aszparagináz, glutamináz, ureáz, aciltranszferáz, pl. penicillináz, liázok, pl. hialuronidáz. Egyéb fehérjék mint pl. a plazma-alkatrészek (globulinok, antitestek). 10 Polipeptidek, mint a kallikrein inhibitor vagy inzulin. Aminosavak, mint a lizin vagy alanin. A találmány szerint alkalmazott fehérjéket általában baktériumokból, gombákból, Aktinomy-15 cetesekből vagy állati nyersanyagból nyerjük ki. A rögzített enzimekkel végrehajtott műszaki szempontból fontos reakciókra néhány példa a keményítő hidrolitikus lebontása kovalens kötésű amilázzal, gyümölcslevek derítése többek között 20 kötött pektinázzal, enzimatikusan lebontott fehérjehidrolizátumok előállítása, a penicillinek hidrolízise 6-aminopenicillánsawá. Ezenkívül a rögzített enzimek, peptidek többek között felhasználhatók inhibitorok elkülönítésére affinitáson alapuló kro-25 matográfiával és fordítva rögzített inhibitorok alkalmazhatók enzimek elkülönítésére. Egyéb felhasználási területek az orvostudomány területén vannak. Ilyen példa megkötött L-aszparagináz vagy ureáz alkalmazására szervezeten kívüli keringésben 30 a vér aszparagin- illetve karbamid-szintjének csökkentése céljából. A felsorolt és sok egyéb alkalmazási lehetőséget a szakirodalom ismerteti, összefoglaló szakirodalomként pl. megemlítjük a Chem. Eng. News 1971. 35 február 15-i számában a 86. oldalon és a Rev. Pure a. Appl. Chem. 21, 83 oldalon (1971) megjelent cikkeket. A találmány szerinti fehérje-készítmények alkalmazására fontos példát jelent a penicillinek hasítása 40 olyan penicillin-aciláz segítségével, amelyik a találmány szerinti kopolimerhez van rögzítve. A 6-aminopenicillánsav (6 APS) előállítására a penicillineket acilázok segítségével mikroorganizmusokból, mint pl. baktériumokból főként E. coli, Er-45 winia vagy Actinomycetes-ből mint Streptomyes, Micromonospora, Nocardia és gombák, mint Fusarium és élesztők segítségével hasítjuk. Az 1111 778 számú NSzK szabadalmi leírás 50 6-APS előállítására ismertetett eljárása szerint penicillin . G-oldatot egy baktérium iszappal hozunk össze, amely a penicillin-aciláz enzimet (E. C. 3.5.1.11.) tartalmazza. Az enzim behatása alatt a penicillin oldalhelyzetű karbonamid-csoportja le-55 hasad anélkül, hogy a 0-laktámgyűrű felnyílna. A mikroorganizmus-szuszpenziók alkalmazásának a következő hátrányai vannak: a) a mikroorganizmusok szuszpenziója az 60 intracelluláris penicillin-acilázon kívül további fehérjéket és enzimeket, valamint a táptalajból és annak átalakulási termékeiből olyan komponenseket tartalmaz, amelyek a fermentáció során képződtek. Ezek a szennyeződések a feldolgozásnál 65 nem teljesen moshatók ki a kristályos 6-APS-ből. 4