167316. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3-acil-hidrazonometil-rifamicin-SV-származékok előállítására
7 167316 8 a kezdeti tájékozódó vizsgálatok céljaira emberi „normál" szövet-sejttenyészetekből (1788) nyertünk kevésbé tisztított polimerázokat. Az érdekesnek bizonyuló vegyületeket ezután részletesebben tanulmányoztuk normál és leukémiás vér lymphocitákból származó erősebben tisztított enzimekkel. Ezeket a szövettenyészet-sejteket az Associated Biomedic Systems, Inc. bocsájtotta rendelkezésünkre. DMS-polimeráz-készítmények Sejt DNS-polimerázokat extraháltunk és tisztítottunk norma vér (PHA-val stimulált) lymphocitákból, leukémiás vér lymphocitáiból és (1788) lymphoid sejtekből, hipotóniás pufferoldatban való homogenizálással, ezt követte az extralizozomális részecskék Triton X 100-zal és/vagy erős sós extrahálással végzett kivonása. Differenciál-centrifugálás után a sejt-extraktumokat DEAE-cellulózos, foszfocellulózos és Sephadex G200-as oszlopkromatográfiával tovább tisztítottuk. DNS-polimeráz vizsgálatok A DNS-polimeráz vizsgálatokat 100 jul végső térfogatban végeztük. A vizsgálati keverék 50 mmól Trisz-HCl puffert, pH = 8,3, 6,0 mmól MgAC-ot, 8,0 mmól ditiotreitet és 60 mmól NaCl-ot tartalmazott. A pH beállítását előzőleg dimetilszulfoxidban (DMSO) oldott inhibitorok hozzáadásával végeztük. A DMSO végső koncentrációja 0,5% volt, s minden kontrollminta is tartalmazta ezt a DMSO mennyiséget. A vizsgalatban olyan enzimkoncentrációt alkalmaztunk, ami körülbelül l,0pmól/óra beépülést katalizál. Az enzimet a legtöbb esetben 5 percig előinkubáltuk az inhibitor vegyülettel. A reakciót ezután templát beadagolásával iniciáltuk: vagy szintetikus DNS-t (poly d/AT/ Miles Lab.) és DNS.RNS hibridet (oligo dT.poly rA) 5 g/ml koncentrációban vagy természetes templátokat: akvitált lazacsperma DNS-t 50íig/ml koncentrációban és endogén 70S vírusos RNS-t alkalmaztunk, továbbá 10 Ci(3H-metil)TTP-t (New England Nuclear, 18,6 mCi/jumól, liofílizálva és feloldva 0,01 mól HCl-ben közvetlenül felhasználás előtt) és dATP-t (8 • 10"s mól, szintetikus templáttal), vagy mind a három dezoxinukleozidtrifoszfátot (8- 10"s mól RNS vagy DNS irányított reakciókkal). Némelyik kísérletben az enzimet nem inkubáltuk előre az inhibitorral. Ezekben az esetekben a reakciókat úgy iniciáltuk, hogy az inhibitort tartalmazó teljes reakciókeverékhez adagoljuk az enzimet. Az inkubáció megkezdésekor és 30 perc múlva mintákat vettünk, ezekben a folyamatot 2 ml 0,08 mól nátriumpirofoszfáttal befejeztük és 12,5%-os hideg triklórecetsavban (TCA) hordozóként élesztő-RNS-val (400 jug) kicsaptuk. A terméket Millipore szűrőn összegyűjtöttük, alaposan átmostuk 5% TCA és lml DMSO- etilalkohol-0,1 mól NaCl (0,5 :70 :29,5) keverékkel, megszárítottuk és Packard-féle folyadék-szcintillációs számlálóban 2 ml BBS3-ban (Beckman) és 10 ml liquifluorban (New England Nuclear) megszámoltuk. Azt találtuk, hogy az 5-20 jug/ml-es koncentrációk szintetikus DNS-templáttal a leukémiás polimerázt 50%-ban gátolják. A szintetikus RNS templáttal (poly rA.rU) irányított reakció még érzékenyebb volt. Természe-5 tes templáttal, normál- és tumorsejt-polimerázon végzett reprezentatív kísérletek szerint a tumorenzimek érzékenyebbek voltak a vizsgált vegyületekre. Az új rifamicin-származékok egyéb biológiai jellemvonásai: egér, patkány és ember sejtjeinél a 10 Moloney és Kirstein-féle egér-sarcoma vírustörzs által előidézett fókusképződést gátolják, a már transzformált egér és emberi sejtek vírustermelését szelektíve gátolják, a visszafejlődő sejtek kimutatása, egér-sarcoma-vírus által transzformált nem-ter-15 melő egér- és patkány-sejtrendszereket használva. A találmány szerinti eljárás rifamicin vegyületei ezenkívül szelektív toxicitást mutatnak vírustranszformált egér, patkány és emberi sejteknél, ha azok kolóniaképző képességét vizsgáljuk. A vegyületek 20 gátló hatását BALB/3T3 szövettenyészeten Moloney sarcoma-vírus által előidézett fókuszképződésre a következő eljárással vizsgáltuk: BALB/3T3 sejtkultúrákat tenyésztettünk 25 250 ml-es műanyagpalackokban, „Eegle féle minimális szükséges táptalaj "-t és 10% főtális marhaszérumot tartalmazó táptalajon. A sejteket tripszin-EDTA-val szuszpendáltuk és táptalajjal hígítottuk, majd a sejtszámlálást Coulter számlálóval végeztük. 30 Tumor-homogenátumként Moloney egér-sarcoma-vírust használtunk. Négy passzázst végeztünk svájci származású nagy passzázs-számú egérembrio-sejt-tenyészetben és a fókuszképző egységeket BALB/3T3 sejtekben vizsgáltuk. A vizsgálatok elvég-35 zéséhez a Hartley és Rowe [Proc. Nat. Aced. ,Sci., 55, 780, (1966)] által leírt módszer módosított változatát alkalmaztuk. Jelen esetben a palackokat 25 ml táptalajban levő 1-2 • 106 sejttel beoltottuk és 37 C°-on 24 óráig inkubáltuk. A folyadék 40 eltávolítása után az előre meghatározott számú fókuszképző egységekkel rendelkező vírust 0,5 ml táptalajra helyeztük és a sejtek egyetlen rétegén 37 C°-on, 90 percig adszorbeáltattuk. Ezt az adszorpciós periódust követően előre meghatározott 45 mennyiségű, rendszerint körülbelül 5-10jug/ml rifamicin-vegyületet (amit előzőleg 1 mg/ml-es koncentrációban dimetilszulfoxidban oldottunk) adagoltunk hozzá 25 ml táptalajban és a kultúrákat visszatettük a táptalajra. Kontrollként csak dimetil-50 szulfoxidot tartalmazó táptalajt adtunk egy külön tenyészethet. 3 napos inkubálás után a kultúrák folyadékát cseréltük és a hetedik napon megszámoltuk a transzformált sejtek fókuszait. Ugyanilyen módszerrel vizsgáltunk New Jersey 55 szerotípusú vesicularis stomatitis vírust is. Az ennek a vírusnak a tenyészetéhez és vizsgálatához használt módszert Hackett és társai, Virology, 31, 114, (1967) írták le. Ezek a tulajdonságok bizonyítják, hogy a 60 találmány szerinti vegyületek vírusok által állatokon előidézett tumorokra hatékony gátló hatást gyakorolnak. A találmány szerinti néhány reprezentatív vegyület előállítását a következő példák szemlél-65 tetik. 4
