167276. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A-27106 jelű metabolit előállítására
167276 13 14 az A 27106 metabolit előállítására fermentációs úton. 250 ml-es Erlenmeyer-lombikban 55 ml táptalajon, 47 órán át a 3 501 568 számú USA-beli szabadalmi leírás szerint Streptomyces cinnamonensis ATCC 15413-at tenyésztünk, amikor vegetatív inokulumot kapunk. Ezt a vegetatív inokurumot 220 ml, egy literes Erlenmeyer-lombikban sterilezett táptalajhoz adjuk, és főfermentációs inokulum előállítására 21 órán át rázatjuk. Ezzel az inokulummal 40 literes fermentorban hővel sterilezett, a következő összetételű táptalajt oltunk: Glükóz 750,0 g Szójaliszt 625,0 g Szójaolaj 500,0 g Metiloleát 500,0 g Polisziloxán olaj 5,0 g (habzásgátló) Káliumklorid 2,5 g Dikáliumhidrogénfoszfát 2,5 g MnCl2 -4H 2 0 15,0 g FeCl3 -hidrát 7,5 g CaC03 25,0 g Desztillált víz 24 liter A táptalaj pH-ja 5,5, amit 10 n káliumhidroxiddal (15 ml) 8,0-ra állítunk be. A beoltott táptalajt 32 °C hőmérsékleten 234 órán át fermentáljuk. A fermentáció 42 órájában a 10 liter percenként átáramoltatott levegőmennyiséget 22,5 literre, a keverést pedig az addigi 500-ról percenkénti 700 fordulatra növeljük. A fermentáció 210. órájában a Bacillus subtilis ATCC 6633 tesztorganizmussal végzett vékonyréteg-értékmérés szerint a monensin-termelés gyakorlatilag befejeződik. A fermentáció 234. órájában a Streptomyces cinnamonensis elpusztítására sterilezzük a tenyészlevet, majd a következő anyagokat adjuk hozzá: Dextróz zSójaliszt MnCl2 -4H 2 0 CaC03 FeCl3 -6H 2 0 KCl K2 HP0 4 Metiloleát Szójaolaj Desztillált víz 750 g 625 g 155 g 12,5 g 7,5 g 2,5 g 2,5 g 250 ml 250 ml 24 liter A táptalaj pH-ját 215 ml 5 n nátriumhidroxid oldattal 8,0-ra állítjuk be, majd sterilezzük. A steril táptalajt beoltjuk a Streptomyces candidus NRRL 5449 gyorsan növekvő vegetatív tenyészetével és 30 °C hőmérsékleten 137 órán át indukáljuk. A táptalajon percenként körülbelül 10 liter steril levegőt buborékoltatunk át. A táptalajt a fermentáció első 16 órájában, általánosan használt keverővel percenkénti 120, a 40. óráig percenkénti 420, majd percenkénti 500-as fordulattal keverjük. A tenyészéhez a 44., 66,5., 89., 97., 113. és 127. órában 400 g dextrózt, a 72. és 99. órában 175 g kalciumkarbonátot adunk. A fermentációt az előzőekben megadottak szerint vékonyrétegkromatográfiával ellenőrizzük. A te-5 nyésztés 137. órájában az A 27106 metabolit termelése gyakorlatilag befejeződik. Az A 27106 el^ különítésére és tisztítására a 2. példában megadott eljárást ismételjük meg. 10 4. példa Az A 27106 előállítása a Streptomyces candidus elkülönített enzimjével 100 liter táptalajban, az 1. példa szerinti eljárást megismételve, Streptomyces candidus NRRL 5449-et tenyésztünk. Csökkentett nyomáson kivitelezett szűréssel elkülönítjük a sejteket a táptalajból, majd ezeket 200 g súlyú részletekben fagyasztjuk és tároljuk. 15 20 25 30 35 40 Két 200 g-os mintát szobahőmérsékleten feloldunk, majd annyi 0,05 mólos pH 5,8-as foszfát pufferhez adjuk, hogy a szuszpenzió végtérfogata 600 ml legyen. 30 percen át ultrahanggal kezeljük a sejteket, majd 30 percen át 10 000-es fordulattal centrifugáljuk a szuszpenziót. A sejttörmeléket 100 ml, a fentiekben megadotthoz hasonló pufferban szuszpendáljuk, és a szuszpenziót 18 órán át 5 liter, a fentihez hasonló, hűtött pufferral szemben dializáljuk. 50 ml dializáit szuszpenzióhoz 120 mg D-glükózt és 25 mg, 2 ml etanolban oldott monensint adunk. 72 órán át 30 °C hőmérsékleten keverjük az elegyet, majd szűrjük, a szűrletet 100 ml kloroformmal extháljuk. Csökkentett nyomáson, desztillacioval eltávolítjuk a kloroformot az oldatból, a desztillációs maradékot 10 g szilikagélen kromatografáljuk. Az ellenállás etilacetáttal végezve, az eluátumban csak nyomnyi mennyiségű monensint találunk. Az eluálást etilacetát és metanol 19:1 arányú elegyével folytatva 17 mg, a 2. példában megadott eljárással előállított termékkel azonos A 27106 metabolitot kapunk. 45 5. példa A coccidiosis-os megbetegedés gátlása a A 27106 metabolittal A kísérleteket 75 egyhetes, egészséges, inkubátor-50 ban és telepen nevelt, keresztezett, nehéz boiler fajtájú hím csibékkel végezzük. 5 X 15-ös csoportba osztjuk az állatokat, és mindegyik csoportot 3 állatból álló, 5 alcsoportba osztjuk. Az alcsoportokba tartozó állatokat elkülönítjük a többi állattól. Az el-55 ső csoportot nem kezeljük; ezek egészséges állatok, jó körülmények között tartjuk őket. A második csoportba osztott állatokat hatóanyaggal nem kezeljük, viszont orálisan 105 spórázott Eimeria tenella oocistát adva nekik, coccidiosis-t váltunk ki ben-60 nük. A harmadik, negyedik és ötödik csoportba osztott állatokat a második csoport állataihoz hasonlóan kezeljük, azzal a különbséggel, hogy 24 órával a fertőzés után olyan táplálékot adunk nekik, amely kilogrammonként 100, 150, illetve 200 mg 65 A 27106 metabolitot tartalmaz. 7
