167273. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dezacetoxi-cefalosporin C előállítására

167273 21 22 ciális nyomelemeket igényelnek növekedésükhöz, fejlődésükhöz és metabolizmusuk teljes lezajlásához. Ezeket a nyomelemeket hozzá is adhatjuk a táptalajhoz, azonban az esetek többségében szennyezőanyagként elegendő mennyiségben jelen vannak a többi táptalajösszetevőben. A Cephalosporium, Emericellopsis, Scopulariopsis, Paecilomyces és Diheterospora mikroorganizmusok kismennyiségű dezacetoxi-cefalosporin C előállítására kis térfogatú, például 1 literes lombikokban rázatás közben tenyészthetők. Nagyobb mennyiségű cefalosporinszármazék előállítására az organizmusokat nagyobb térfogatú fermentorokban, süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között tenyésztjük. A dezacetoxi-cefalosporin C nagyobb mennyiségeinek előállítására a találmány szerinti eljárás előnyös kivitelezési változata szerint úgy járunk el, hogy ferdeagaron tenyésztjük a termelő törzset. A ferdeagar-tenyészetről nyert spóraszuszpenzióval kis térfogatú vegetatív inokulumot oltunk. A vegetatív tenyészetet inkubáljuk, amikor igen gyorsan növekedő tenyészetet kapunk. A kinőtt vegetatív tenyészettel ezután beoltjuk a főfermentációs táptalajt. Esetenként előnyösen úgy járunk el, hogy a főfermentációs táptalaj oltása előtt még egy vegetatív tenyésztést iktatunk közbe. A második vegetatív tenyészettel általában abban az esetben oltjuk a főfermentációs táptalajt, ha ez utóbbi térfogata lényegesen nagyobb, mint a vegetatív inokulum térfogata. így oly módon járunk el, hogy az organizmus spóráival kis térfogatú vegetatív tenyészetet oltunk, és ezzel inokulálunk egy ennél nagyobb férfogatú táptalajt. Ez utóbbi tenyészet már megfelelő mennyiségű sejtet tartalmaz ahhoz, hogy a nagy térfogatú főfermentorban gyors növekedés következzen be. A vegetatív tenyészet táptalaja a főfermentációs táptalajjal azonos összetételű is lehet, de tartalmazhat más táptalaj összetevőket is, amelyek elősegítik a termelő organizmus növekedését és fejlődését a kis térfogatú tenyészetben. A találmány szerinti eljárás során használt mikroorganizmusok 6,2 és 8,0 közötti pH-jú táptalajon nőnek a legjobban és termelnek dezacetoxi-cefalosporin C-t. A nagyobb méretű fermentorokban, a süllyesztett, aerob fermentációs körülmények köközötti tenyésztéskor a táptalaj pH-ja a kezdeti 6,5-ről 7,5-re emelkedik. A találmány szerinti eljárás során használt mikroorganizmusok 20 °C és 35 °C közötti hőmérsékleten nőnek a legjobban. A dezacetoxi-cefalosporin C a legnagyobb mennyiségben abban az esetben szintetizálódik, ha a fermentációs hőmérséklet 26 °C. A dezacetoxi-cefalosporin C a legnagyobb menynyiségben akkor keletkezik, ha a nagy térfogatú fermentorban a tenyésztést 4—7 napon át végezzük. Ha a tenyésztést kis térfogatú tenyésztőedényben, például 1 literes rázatott lombikban végezzük, úgy az organizmusok növekedése sokkal gyorsabb, és a dezacetoxi-cefalosporin C rövidebb idő alatt, például az oltást követő második vagy harmadik napon jelenik meg a tenyészlében. Abban az esetben, ha a főfermentációs táptalaj pH-ja a tenyésztés során eléri a 3,0-et, vagy ennél is magasabb értékre emelkedik, a dezacetoxi-cefalosporin C termelése csökken. Ezért a fermentáció során időről-időre ellenőriznünk kell a táptalaj pH-ját. Abban az esetben, ha úgy látszik, hogy a táp-5 talaj pH-ja eléri a fenti értéket a maximális antibiotikum-termelés bekövetkezése előtt, úgy a szokásos módon, megfelelő sav vagy pufferhatású oldat adagolásával csökkentjük a tenyészlé pH-ját. A dezacetoxi-cefalosporin C termelését a fermen-10 táció során a tenyészlé kromatográfiás vizsgálatával ellenőrizzük. Az antibiotikum termelését bioautográfiás úton is követhetjük. A beioautográfias vizsgálatokat Pseudomonas solanacearcum tesztorganizmussal végezzük. 15 Mint ahogy a süllyesztett, aerob fermentációk esetén szokásos, a tenyésztő táptalajon steril levegőt buborékoltatunk át, amikor a termelő organizmus jobban nő és nő a fermentációs termékek menynyisége is. A táptalajon percenként általában leg-20 alább tenyészlé-térfogat egyötöd részének megfelelő mennyiségű levegőt vezetünk át. Nagyobb mennyiségű levegő bevezetésekor azonban gyakran több dezacetoxi-cefalosporin C szintetizálódik. A fermentáció során a kialakuló habréteg csök-25 kentésére habzasgátló szert célszerű adagolni. Ilyen például az Antifoam A (szilikonolaj) vagy Polipropilénglikol P—2000, mindkettő a Dow Chemical Company terméke. További alkalmazható habzasgátló szer például a gyapotolaj vagy szójaolaj, de 30 bármely más ismert habzásgátlót használhatunk. Az ilyen jellegű habzásgátlók egyben szénforrásként is szolgálnak. A találmány szerinti eljárás során használt gombák többsége a dezacetoxi-cefalosporin C és a jel-35 lemző penicillin N mellett dezacetil-cefalosporin C-t, cefalosporin C-t és esetenként a dezacetil-cefalosporin C-vel alkotott laktonszármazék mellett más, nem azonosított metabolitokat is termel. Mivel a fenti vegyületek közül néhány sav jelenlétében 40 bomlik, a dezacetoxi-cefalosporin C-nek a tenyészléből való elkülönítésekor előnyösen úgy járunk el, hogy a teljes tenyészlevet rövid időn át savas pH-értéken tartjuk, amikor a dezacetoxo-cefalosporin C mellett jelenlévő szennyezőanyagok egy része el-45 tűnik. A penicillin N-t úgy távolítjuk el a tenyészléből, hogy penicillináz enzimet adunk hozzá. A dezacetoxi-cefalosporin C-t az így előkezelt szűrt tenyészléből elkülönítjük és ioncserélő oszlopon kromatografálva elválasztjuk a fermentációs 50 táptalaj többi összetevőjétől. Ezt követően cellulózból vagy szilikagélből készült kromatografáló oszlopon tovább tisztítjuk, majd kicsapjuk oldatából és kikristályosítjuk. A találmány szerinti eljárás előnyös kivitelezési 55 változata szerint a szennyezőanyagok eltávolítására úgy járunk el, hogy a szűrt tenyészlevet előzetes tisztítási lépésként vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel, például n-butanollal vagy amilacetáttal extraháljuk. A kiextrahált tenyészlevet aktív szén-60 bői készült kromatografáló oszlopon tovább tisztítjuk. A kromatografálást például Pittsburg (12x40) aktív szénből készült oszlopon végezzük, a vízben oldódó színes szennyezőanyagok és a vízben oldódó szervetlen vegyületek eltávolítására az oszlopot víz-65 zel mossuk. A fermentációs termékeket 50%-os 11