167256. lajstromszámú szabadalom • Eljárás orgotein tisztítására
167256 20—40 °C hőmérsékleten végezzük. Az optimális hőmérséklet az alkalmazott enzim aktivitástól és stabilitásától függ. Az enzim-kiindulási protein arány elsősorban az elegy orgotein-egyéb protein arányától függ, azaz minél nagyobb az egyéb protein aránya a kiindulási elegyben, annál több enzimre van szükség. Az enzim mennyisége a kiválasztott enzim aktivitásától is függ. Az optimális arányt az enzim ismert proteolítikus aktivitásából és az elegyben jelenlévő lebontani kívánt protein mennyiségéből számítjuk ki a McCord és Fridovich [Biol. Chem. 244, 6049— 6055 (1969)] illetve a Blanchamp és Fridovich [Anal. Biochem. 44, 276 (1971)] által ismertetett szuperoxid-diszmutóz (SOD) módszerrel. Az arány általában nem függ az elegyben jelenlévő orgotein mennyiségétől. Az enzim súlyaránya a kiindulási elegy proteintartalmához viszonyítva általában kisebb I-nél, így 1:2—1:100 között lehet. A pontos arány, mint említettük, a kiválasztott enzim proteolítikus aktivitásától és az elegyben jelenlévő egyéb protein mennyiségétől függ. Az így tisztított orgoteint több eljárással különíthetjük el vagy tisztíthatjuk tovább. A proteolítikus úton lebontott proteineket — oligopeptideket vagy aminosavakat — könnyen elkülöníthetjük a fentiek szerint tisztított orgoteintől. Erre a célra egyszeri vagy többszöri ioncserélő kromatografálást vagy gélszűrést alkalmazhatunk, továbbá oldószerrel vagy ammóniumszulfáttal végrehajtott frakcionált kicsapást és/vagy ultracentrifugás vagy membrándialízist alkalmazhatunk. Mivel a membrándialízis gyors, hatásos és olcsó, alkalmazása igen előnyös. Ha az oldatban protein-jellegű szennyeződések maradnak vissza, akkor ezeket előnyösen a proteolízissel lebontott proteinek elkülönítése után távolítjuk el. Az eltávolítást több eljárással hajthatjuk végre, így gyengén bázisos vagy gyengén savas ioncserélő oszlopon végrehajtott adszorpcióval és elucióval. A protein-jellegű szennyeződéseket egyéb eljárásokkal is eltávolíthatjuk, így gélszűrő-oszlopon végrehajtott kromatográfiával, oldószerrel, így acetonnal vagy etanollal vagy ammóniumszulfáttal végzett frakcionált kicsapással, továbbá — például a 3 624 251 számú USA szabadalmi leírásban ismertetett módszer szerint — melegítéssel, előnyösen 70—75 °C-ra történő melegítéssel. Az alábbiakban a találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül példák segítségével mutatjuk be. A példákban említett enzimek közül a pankreatin 4XN. F., Grade VI minőségű, a papain aktivitása 25 BAEE egység/mg, a sertéspeptidáz (Grade I) aktivitása 30 egység/g, a bromelain (Grade II) aktivitása 3000 egység/mg, a szubtilizin (Type VIII) aktivitása pedig 10 egység/mg. Valamennyit a Sigma Chemical Co. cég, (St. Louis, Missouri, USA) gyártja és hozza forgalomba. A Streptomyces griseus proteinázt a K and K Laboratories cég (Hollywood, Kalifornia, USA) gyártja és hozza forgalomba Pronáz néven. A példákban említett fémionok közül a kalciumionokat CaCl2-dal, a mangánionokali MnS04 -tal biztosítjuk. A triszpuffer trisz-(hidroximetil)-aminoetán. A nátrium-10 15 20 acetát-puffer 1 mólos nátriumacetát oldat, amelyet 1 mólos ecetsavval 5,0 pH-ig titráltunk. 1. példa 1 kg marhamájat 2 liter olyan 7,5 pH-jú 0,025 mólos trisz-puíferben szuszpendálunk, amely 0,3 mól szacharózt és 0,05 mól káliumkloridot tartalmaz. A szuszpenziót 1—2 órán keresztül 13 000 g mellett centrifugáljuk. A zavaros felülúszó térfogata 2150 ml, pH-ja 6,3. A felülúszó 100 ml-es részleteit (60 mg/ml protein, 0,15—0,3 mg/ml, ctZclZ cl proteinekre számítva 0,25—0,5% orgotein) szobahőmérsékleten kb. 20 órán keresztül az I. táblázatban megadott proteolítikus enzimekkel emésztjük. Mivel célunk a legnagyobb gazdasági előnyöket biztosító ipari eljárás kidolgozása volt, a táblázatban szereplő enzimeket inkább viszonylagos költségük, mint hatásosságuk alapján választottuk ki. 1. táblázat Enzim Enzim menypH, puffer A termék 25 nyisege tisztíKí100 ml tás* orsérlet májgotein szaextraktumra tartalma 30 vonatkoztatva a. Strept. griseus 200 mg 8,0, 1 mólos trisz-puffer 35 proteináz (Pronáz +1 ml 0,1 mól Ca+ + (végső térfogat 114 ml) 20—50% 40 b. Pankreatin 15 g 7,5, 1 mólos trisz-puffer végső térfogat 150 ml) 5-10% 45 c. Szubtilizin 40 mg 7,5, 1 mólos (végső térfogat 105 ml) 2,5-5% d. Sertés 166 mg 7,0, 1 mólos 50 peptidáz trisz-puffer (végső térfogat 112 ml) 0,37— 3,75% 55 fin e. Papain (carica papayából elkülönítve) 16 mg 6,3 (végső térfogat 100 ml) 1,7-3,5% Bromelain 9 g (ananászból elkülönítve) 65 5,2 1 mólos nátriumacetát (pH 5,0, (végső térfogat 136 ml) 1,7--3,5% 3
