167248. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fermentációs úton stabil, kristályos nasztatin előállítására és izolálására a fermentációs táptalaj enzimes kezelése mellett

167248 5 6 Mindkét táptalaj esetén, a viszkozitás értéke lényegesen csökkent az enzimatikus kezelés hatására, és ezzel egyidejűleg a kj,a értéke megnövekedett. Tehát a szárazanyagtartalom megnövelése ellenére, ugyanabban a fermentorban ugyanolyan kevertetési-levegőztetési feltételek mellett, mint amelyek mellett csak hígabb táptalajt tudtunk kielégítő eredménnyel használni, megnövelt szárazanyag tartalommal végezhetjük a fermentálást, kedvező oxigén-ellátottság mellett. A találmány szerinti eljárással készített alacsony viszkozitású, de magas szárazanyagtartalmú fermentációs táptalaj alkalmas csőfermentorban végzendő fermentációra is; bár csőfermentorokban a megfelelő mennyiségű oxigén biztosítása kevésbé érhető el, mint keverős fermentorokban, az alacsony viszkozitású táptalaj alkalmas sikeres nisztatin fermentációra csőfermentorokban is. A találmány előnyös foganatosításakor, a táptalaj elfolyósítasat oly módon hajtjuk végre, hogy a viszkozitás 0,1—0,5 Poise között legyen. A találmány foganatosításához alkalmazott Stxeptomyces noursei SN—63 jelű törzset az Országos Közegészségügyi Intézetben 00108 sz. alatt letétbe helyeztük. A törzset kísérleteink során állítottuk elő, s jellemző tulajdonsága, hogy aktinofágrezisztens. A rezisztencia kifejlesztése önmagában ismert módon történt. (S. G. Bradley, L. A. Jones: Progr. Ind. Microbiol. 7, 43—75, 1968). A találmány értelmében az előzőekben ismertetett fermentációs eljárással kapott nisztatin tartalmú szárított micéliumot —10 és +5 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen kalciumkloridos metanollal extraháljuk. Azt találtuk, hogy ezen alacsony hőmérséklet tartomány nagyfokú szelektivitást biztosít a szennyeződésektől történő elválasztásra, mivel a szennyeződés ebben a hőmérséklet tartományban gyakorlatilag nem extrahálódik, míg a céltermék jól oldódik. Az eddig ismert eljárások szerint a nisztatin extrakcióját, mint ahogy ezt a technika állásának ismertetésekor említettük, magasabb hőmérsékleten, legalább szobahőfokon végezték. A nisztatin oldószeres közegben szobahőfokon stabil, 40—50 °C-on pedig jelentős bomlást szenved. A találmány szerinti eljárás során alkalmazott alacsony hőmérsékleten a nisztatin bomlása elenyésző. Az V. és VI. táblázatban bemutatjuk, hogy az idő növekedésével a nisztatin milyen mértékben bomlik a hőmérséklet függvényében. V. táblázat Nisztatin késztermék bomlása 2% kalciumkloridot tartalmazó metanolos oldatban —2°C bom- +25°Cbom- +40 °C bom-L, nisztatin lás nisztatin lás nisztatin lás ora E/ml % E/ml % E/ml % 0 159460 0 159460 0 159460 0 3 157824 1 135360 15 129344 19,6 6 153408 3,7 111592 30 105280 33,5 24 150400 5,5 97056 38,8 96656 38,9 48 135360 15,0 96136 39,0 96416 38,9 VI. táblázat Nisztatin tartalmú extraktlé bomlása (616 E/mg nisztatint tartalmazó micéliumból) 2% kalciumkloridot tartalmazó metanolban. -2°C bom- +25 °C bom- +40°C bom,° nisztatin lás nisztatin lás nisztatin lás ora E/ml % E/ml % E/ml % 10 0 213580 0 213580 0 213580 0 3 195520 8,5 168488 20,8 162432 24,6 6 187552 12,2 141376 33,8 137376 35,2 24 171456 19,7 138368 35,2 90240 57,5 48 144384 32,2 126336 41,2 84224 60,0 15 A táblázatokból kitűnik, hogy a nisztatin már szobahőmérsékleten történő extrakcíó során is jelentős bomlást szenved, továbbá az extrakció során kivonatolt szennyeződések mellett lényegesen gyor-20 sabban bomlik, mint a kísérő szennyeződések nélküli. A VII. táblázatban az extrahált kísérő szennyeződések mennyiségét tüntetjük fel a hőmérséklet függvényében. Az extrakciót mindegyik esetben 25 616 E/mg nisztatin tartalmú micéliumból végeztük 30 percen át 2% kalciumkloridot tartalmazó metanollal. A nisztatint tartalmazó micélium és metanol súlyaránya 1:3,5. 30 VII. táblázat —20 °C +25 °C +40 °C szárazanyag súly% 9 12,7 14,7 35 A táblázatból kitűnik, hogy a hőmérséklet emelkedésével az extrahált szennyeződés mennyisége jelentősen növekszik. A továbbiakban az extraktum feldolgozásakor 40 ismert módon járunk el. A találmány szerinti eljárás alkalmazása új lehetőséget biztosít a táptalajok koncentrációjánaknövelésére oly módon, hogy viszkozitásuk nem emelkedik és oxigénellátottságuk változatlan, így a fer-45 mentáció gazdaságossága növekszik, a nisztatin képződés szintje magasabb. Eljárásunk további előnye, hogy a fermentáció során az enzimes elfolyósítás eredményeként nem vagy kevés olajat kell alkalmazni habzásgátlóként és így a korábbi 50 eljárásoknál nagy gondot okozó olajmentesítésre nincs szükség. A találmány szerinti feldolgozási eljárás lehetővé teszi a kevés hatóanyagtartalmú micélium feldolgozását is. A találmány szerinti eljárással előállított stabil nisztatin átlagosan 5000 55 E/mg aktivitású, mely érték számottevően magasabb az eddig ismert eljárásokkal előállított nisztatin aktivitási értékénél. Eljárásunkat az alábbi példákkal illusztráljuk anélkül azonban, hogy találmányunkat e példákra 60 korlátoznánk. 1. Streptomyces noursei SN—63 (MNG) törzs fagyasztott spóraszuszpenziójával beoltjuk a következő összetételű steril inokulum táptalajt: kukoricaliszt 3,0%, kukoricalekvár (sz. a.) 0,5%, kal-65 ciumkarbonát 1,0%, ammóniumnitrát 0,4%, nát-3