167243. lajstromszámú szabadalom • Eljárás redukált B12 vitamin (B12r), hidroxokobalamin, valamint alkilkobalaminok és sóik előállítására
167243 gén átbuborékoltatásával jutunk a kívánt termékhez. Mindkét utóbbi származék esetén közvetlenül abszolút acetonnal való hozzáadással kristályosíthatunk. Igen nagy tisztaságú termék előállítása céljából a kapott oldatot H-formában levő CM-cellulóz-oszlopon engedjük át, melynek során a hidroxokobalamin erősen, az egyes szennyezőkomponensek pedig ettől eltérő módon (gyengébben vagy erősebben) kötődnek meg. A fotolízis során lehasadt adeninszármazékok a CM-cellulóz-oszlopról desztillált vizes mosással, az át nem alakult B12 koenzim híg, 10~ 3 n elektrolit oldattal történő elucióval eltávolíthatók. Ennél az eluciós lépcsőnél a hidroxokobalamin még teljes mértékben kötve marad, ha megkötésére az oszlop teljes kapacitásának kedvező hányadát (50%-át) vesszük csak igénybe. A hidroxokobalamin eluálására optimális az 5-10~3 n sóoldatok alkalmazása. Ilyen körülmények között az eredeti oldat szennyezései az oszlopon még kötve maradnak és csak nagyobb sókoncentrációjú oldatokkal eluálhatók. Az eluáló elektrolitek célszerű megválasztásával a hidroxokobalamin különböző anionokkal alkotott sója nyerhető. A főfrakcióból a terméket közvetlen kristályosítással izoláljuk. A nyers termék tisztasága megfelel a gyógyszerkönyvi előírásoknak (BP 1968). A kromatografálási mellékfrakciókat (elő- és utó), valamint az anyalúgokat egyesítve a kobalaminokat B12 vitaminná alakítjuk át nátriumcianid adagolásával, majd azt ismert módon kristályosan izoláljuk. A B12r illetve alkilkobalaminok előállításánál — miután azok gyógyszerkönyvben nem szerepelnek — a terméket spektrumok illetve Rf-jük alapján azonosítjuk. Az eljárás segítségével, egyszerűen és biztonságosan kivitelezhető módon, ipari méretben, igen jó kitermeléssel lehet redukált B12 vitamint és annak származékait —- különös tekintettel hidroxokobalamint — előállítani. Közvetlenül a fermentálás termékéből (B12 koenzim), annak B12 vitaminná való átalakítása és az átalakított termék izolálása nélkül állítjuk elő az említett származékokat. Az előállítási és tisztítási eljárás hozama felülmúlja, a B12 vitaminból kiinduló, a különböző szabadalmi leírásokban megadott hozamokat. Az eljárás gazdasági előnye két tényezőből tevődik össze. Elkerüli a fermentleben közvetlenül keletkezett B12 koenzim átalakításával és izolálásával járó elkerülhetetlen, de nem lényegtelen veszteségeket és ezenfelül felülmúlja a B12 vitaminból kiinduló eljárások hozamát. A nehezen irányítható redukciós út helyett kézbentartott, folyamatos üzemi fotolitikus átalakítással nyeri az alapvegyületet, ebből képezve a fontosabb származékokat. A kitermelések a kiindulási B12 koenzimből elméletileg nyerhető termékre vonatkoztatva a B12 vitaminná visszalakított melléktermékek hozamának beszámításával 95% körül vannak, hidroxokobalamin esetén és kiemelkedőnek mondhatók B12r és alkilkobalamintermékek előállításakor is. Az elmúlt években számos közlemény jelent meg, mely a B12 vitamin, a hidroxokobalamin és a B 12 koenzim, valamint alkilkobalaminok terápiás hatását hasonlítja össze. E szempontból egyöntetű állásfoglalás nem született [Ann. N. Y. Acad. Sei. 112., 5 641/1964. Bull. Soc. Chim. Biol. 47., 336/1965, Dtsch. med. Wschr. 20., 1134/1970]. Az alapvető funkció a vészes vérszegénység gyógyítása. A B12 vitamin a vörös vérsejtek érlelődóséhez szükséges. A hidroxokobalamin azonban értékes tulaj donsá-10 gokkal rendelkezik, melyek előnyt jelentenek a többi B12 vitaminféleséggel, a B 12 vitamin más formáival szemben. A hidroxokobalamin előnye, hogy depot jellegénél fogva kevésbé gyorsan ürül ki, így hosszabb 15 ideig biztosítja a terápiásán hatásos koncentrációt a vérszérumban, ugyanis pozitív töltése révén jobban kötődik a vérszérum fehérjéihez (II Farmaco, Ed. Pr. 17. 566/1962]. A májból például 30 hétig egyforma gyorsasággal ürül, 30 hét és 1 év között 20 pedig lassabban (G. B. J. Glass és Duk Ho Lee, Blood 27/2, 227—33, 1966). Külön ki kell emelni antidotum voltát ciánhidrogén mérgezés esetében, ebből a szempontból egyedülálló az összes B12 származék között. (Ann. Pharm. Franc. 19 740/1961). 25 Alkalmas továbbá cukorbajos páciensek bizonyos neurológiai zavarainak kezelésére, illetve gyógyítására (R. Klinga és P. Dallos Coste, Policlinico Sez. 68, 1548—55, 1961). A hidroxokobalamin számos előnyének felismerése ezen B12 forma ipari elő-30 állítására adott ösztönzést. Az alkilkobalaminok mikrobiológiailag ugyancsak aktívak. így például a metilkobalamin aktivitása — Ochromonas malhamensis teszt organizmussal mérve — 3,5-ször nagyobb a B12 vitamin 35 mikrobiológiai aktivitásánál. (T. Kamikubo, Y. Takeda, M. Hayaski és W. Friedrich: Agr. Biol. Chem. 36. 164. 1972). Az említett B12 származékokat, mind a hidroxokobalamint, mind az alkilkobalaminokat, magából a B12 vitaminból állítják elő 40 redukciós úton. Első lépésként redukált B12 vitamin, a B12r keletkezik minden ilyen lépésnél, és ez a reakcióképes vegyület alakítható tovább a különböző származókokká. Természetesen a B12 vitaminból kiinduló redukciós eljárásoknál gondoskodni kell a 45 lehasadó CN-anion redukálásáról vagy eltávolításáról, mert jelenléte esetében a redukció befejeztével az eredeti termék alakul vissza. A redukció körülményei az igen reakcióképes B12r -t további bomlásra bírják, amikor első lépésben B12r (egy vegyértékű 50 kobaltot tartalmazó vegyület) keletkezik, mely már nem képes származékok képzésére, további redukcióra a molekula szétesik, sárgásszínű bomlástermékek keletkezése közben. Az eljárás további részleteit az alábbi példákban 55 adjuk meg anélkül, hogy találmányunkat a példákra korlátoznánk. Példák 1. 10 g B12 koenzim kristályt tartalmazó vizes 60 oldatot, melynek koncentrációja 500 mg/1 térfogata 20 1 oxigénmentes nitrogénnel oxigénmentesre mosunk. Az oldatot ezután átengedjük zárt rendszerben a fotolizátor készüléken, melyben 0,1 att nyomást tartunk N2 gáz segítségével. A fotolizátor 65 kvarcüvegcső készülék, rétegvastagság 10 mm. 4
