167238. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új hipokalcémiás hatású peptidek előállítására
167238 7Í 72 -Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gm-Thr(tBu)-Ala-Ile-Glfi-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 vegyületet 100 ml 80%-os ecetsavban 16 mg 10%-os palládium-szén-katalizátor jelenlétében rázókacsában, szobahőmérsékleten, 15 órán át hidrogénezünk. A katalizátort leszívatjuk, ugyanezzel az oldószereleggyel mossuk és liofüizáljuk. 54 mg dokozapeptid-amid-acetátot kapunk. Ezt 10 ml meleg metanolban oldjuk, néhány csepp 1 n nátriumhidrogénkarbonátoldattal pH 7,5 érték köré állítjuk és 50 ml 0,1 n nátriumkarbonátoldatban, 0° hőmérsékleten elkeverjük. A tejszerű csapadékot leülepítjük, leszívatjuk, vízzel mossuk és szárítjuk. Szilikagélen végzett vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat során Rf43E = 0,50, Rf 110 = 0,61, Rf52 = = 0,21. 1 | 12. BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asn-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 | | 93 g BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-OH (2. példa 12. pont), 95 mg H-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asn-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 vegyületeket, 14 mg N-hidroxiszukcinimidet és 10 ml dimetilformamidot nitrogénatmoszférában 15 mg diciklohexükarbociimiddel keverünk. A reakcióelegyet 40°-on összesen 20 óráig keverjük, mialatt 2 óra múlva mégegyszer 15 mg diciklohexilkarbodiimidet adunk hozzá. Ezután az elegyet 300 ml abszolút éterben felvesszük, 2 órán át hűtőszekrényben tartjuk, a csapadékot leszívatjuk és éterrel mossuk. Tisztítás céljából a nyers terméket metanol-puffer-kloroform-széntetraklorid (11:3:6:7, puffer megegyezik az 1. példa 18. pontjában leírttal) rendszerben 220 részletben multiplikatíve megoszlatjuk. A tiszta frakciókat (104—121 sz. frakciók, K = 1,0) egyesítjük, bepároljuk és nagy vákuumban 40°-on megtisztítjuk az ammóniumacetáttól. Szilikagélen végzett vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat során Rf45 = 0,60, Rf fl6 = 0,59, Rf 100 = = 0,32. 4. példa Ac-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2-acetát (Cys 1 -acetil-kalcitonin M acetát) _100 mg Ac-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)I -Cys-Met-Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)--Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr (tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 vegyületet nitrogénbevezetés közben 0°-on 3 ml 95%-os trifluorecetsavban felveszünk és teljes oldódás után 90 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. 0°-on 50 ml hideg éterrel kicsapjuk, a szuszpenziót lecentrifugáljuk és a csapadékot még kétszer éterrel eldörzsöljük. A nátriumhidroxid felett nagy vákuumban szárított terméket acetáttá átalakítás céljából 3 ml vízben felvesszük, 0,02 n ecetsavoldattal egyensúlyba hozott bázikus ioncserélő (pl. Merck; 7,5 mm; 20 cm) oszlopra visszük fel és 0,02 n ecetsavoldattal eluáljuk. Az eluátumot 5 25°-on nagy vákuumban bepároljuk, a maradékot vízzel felvesszük és liofüizáljuk. A fehér port tisztítás céljából n-butanol-jégecet-víz (4:1:5) rendszerben (3 ml fázistérfogat) Craig-megoszlatásnak vetjük alá. 600 részlet után a vókonyrétegkromatog-10 ráfiásan egységes terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, nagy vákuumban 25°-on bepároljuk, vízben felvesszük és liofüizáljuk. Nagy vákuumban szobahőmérsékleten nátriumhidroxid felett szárítva amorf por keletkezik. „Selecta" lemezen végzett 51 elektroforézis során (pH 1,9, 1,5, óra, 280 V) a termék —1,8 cm-t fut, pH 4,8-on —1,2 cm-t. „Alox"on végzett vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat során Rf42 = 0,65, R f , 9 = 0,60, Rf45 = 0,72, „Selecta"-n Rf45 = 0,55, Rfl0lA = 0,63, Rf52 = 0,38. 20 A kiindulási anyagot a következőképpen állítjuk elő: 1. TRI-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-OMe 9.1 g TRI-Cys(TRI)-OH és 3,2 g H-Gly-Asn-Leu-25 -OMe vegyületet (2. példa 1. pont) 60 ml dimetilformamidban felveszünk és 0°-on történő keverés közben 3,7 g diciklohexilkarbodiimidet adunk hozzá. 15 órán át 0°-on tartjuk, majd a diciklohexilkarbamidot leszűrjük, a szűrletet szárazra pároljuk és a 30 maradékot kloroform-petroléter elegyből átkristályosítjuk. Op.: 126—130°. Szilikagélen végzett vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat során Rf = 0,27, kloroform-metanol (95:5) rendszerben. 35 2. H-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-OMe-acetát 1,8 g TRI-Cys(TRI)Gly-Asn-Leu-OMe vegyületet 16 ml jégecetben oldunk és szobahőmérsékleten 4 ml vizet csepegtetünk hozzá. Egy órán át szobahőmérsékleten tartjuk, majd 12 ml vizet adunk hozzá, a ki-40 vált tritilkarbinolt leszűrjük és a szűrletet nagy vákuumban 40°-on szárazra pároljuk. Az olajos maradékot terc-butanolban felvesszük és liofüizáljuk. Fehér por keletkezik, amely szilikagélen végzett vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat során kloro-45 form-metanol (8:2) elegyben Rf = 0,45 értéket ad. 3. Ac-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-OMe 1.02 g H-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-OMe-acetát és 0,9 ml jégecet 15 ml kloroformos oldatához 0°-on 50 1,9 g száraz diciklohexilkarbodiimidet adunk. Kb. 10 perc múlva a reakcióelegy péppé dermed. Ezt 10 ml kloroformmal hígítjuk és az elegyet 4 órán át 0°-on keverjük. 30 ml petroléter hozzáadása után leszűrjük és a csapadékot forró kloroformból kikris-55 tályosítjuk. Op.: 156—158°. Szilikagélen végzett vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat során az Rf-érték kloroform-metanol (9:1) rendszerben = 0,25. 4. Ac-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-NH-NH2 60 2,42 g Ac-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-OMe 21 ml dimetilformamidos oldatához 3,75 ml hidrazinhidrátot adunk és az átlátszó oldatot 2 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Ezután 0°-ra hűtjük és keverés közben 150 ml vízzel elegyítjük. A csapadé-65 kot leszűrjük, hideg vízzel mossuk és foszforhent-36
