167238. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új hipokalcémiás hatású peptidek előállítására
167238 63 64 28. H-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OMe 5,66 g fenti karbobenzoxivegyületet 400 ml meleg metanolban oldunk és 1 g 10%-os palládium-szénkatalizátor jelenlétében hidrogénezzük. A katalizátort leszűrjük, majd a metanolt vákuumban 40°-on ledesztilláljuk. A szilárd anyagot azonnal továbbalakítjuk, Rf = 0,2 kloroform-metanol (95:5) rendszerben, szilikagélen. 29. H-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OH 4,3 g fenti tetrapeptidmetilésztert 43 ml metanolban enyhe melegítés közben oldunk. 20°-ra lehűtjük, majd 12 ml 1 n nátriumhidroxidoldatot adunk hozzá. 5 perc múlva 20 ml vizet, majd további 10 perc múlva 12 ml 1 n sósavoldatot és 20 ml metanolt adunk hozzá. A kristályos csapadékot leszűrjük és 90%-os etanollal mossuk. Az anyag 240° felett olvad, bomlás közben. Rf100 = 0,15, szilikagélen. 30a. Z-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OH A 29. pontban leírt tetrapeptidszármazék 4,2 gját 110 ml 90%-os dimetilformamidban szuszpendáljuk, 1,4 ml trietilamint adunk hozzá és addig melegítjük 70°-on, amíg az anyag nagy része feloldódik. 25°-ra lehűtve 4,8 g Z-Gln-ONP vegyületet adunk hozzá, szobahőmérsékleten 18 órán át keverjük, további 2,4 g Z-Gln-ONP vegyületet és 0,7 ml trietilamint adunk hozzá és még 20 órán át 50°-on keverjük. A keletkezett terméket leszűrjük, az anyalúghoz étert adunk és a kivált terméket ugyancsak izoláljuk. A két frakciót 60 ml terc-butanolban szuszpendáljuk, pH 2 értékig 2 n sósavat adunk hozzá és jól eldörzsöljük, majd összesen 600 ml víz részletenkénti hozzáadásával kicsapjuk. A terméket lecentrifugáljuk, még kétszer 200 ml vízzel mossuk és liofilizáljuk. Ezt sok metanolból átkristályosítjuk. Op.: 230° felett, bomlás közben. A^termék 5 mól vizet tartalmaz. Vékonyrétegkromatográfiás eljárás során (szilikagélen) Rf100 = 0,4. 30b. Z-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OMe 4.6 g, 28. pontban leírt H-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OMe 30 ml dimetilformamidos oldatához 3,5 g Z-Gln-ONP vegyületet adunk és szobahőmérsékleten addig keverjük, míg az elegy megszilárdul. Egy éjszakán át állni hagyva, éterrel hígítjuk, a csapadékot leszűrjük és éterrel nitrofenol-mentesre mossuk. A védett pentapeptid szilikagéles vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat során kloroform-metanol (95:5) rendszerben 0,14 Rf -értéket mutat. Op.: 250° felett. 31a. H-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OH-hidroklorid 3.7 g Z-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OH vegyületet 150 ml 80%-os metanolban és 5,5 ml 1 n sósavban szuszpendáhmk, és 2 g 10%-os palládium-szén-katalizátor jelenlétében addig hidrogénezünk, míg az anyag feloldódik és nincsen több hidrogénfelvétel. A katalizátor leszűrése után a szűrletet 30°-on vákuumban erősen bepároljuk, terc-butanollal hígítjuk és liofilizáljuk. Szilikagéles vékonyrétegkromatogramon Rf101 = 0,48. 31b. H-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OMe-hidroklorid 14,4 g, 30b. pontban leírt pentapeptidszármazékot 800 ml 80 % -os metanolban szuszpendálunk és egy ideig 50°-on melegítjük. A szuszpenziót szobahőmérsékletre hűtjük, 20,8 ml sósavat és 3 g 10%-os palládium-szén-katalizátort adunk hozzá és addig 5 hidrogénezzük, míg a hidrogénfelvétel megszűnik és a kiindulási anyag oldatba megy. A katalizátor leszűrése után a szűrletet vákuumban 30°-on bepároljuk és a maradékot dimetilformamiddal kétszer nagy vákuumban bepárolva vízmentesítjük. A ma-10 radékot minden további tisztítás nélkül felhasználjuk. Rf100 = 0,33, szilikagéles vékonyrétegkromatogramon. 32. Z-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-15 -OMe 12,0 g, 31b. pontban leírt pentapeptid-metil-. észter-hidrokloridot 80 ml dimetilformamidban oldunk. Szobahőmérsékleten keverve egymásután 13,3 g Z-Thr(tBu)-Phe-Pro-OH vegyületet és 5,75 g 20 N-hidroxiszukcinimidet adunk hozzá, majd 0°-on 2,76 ml trietilamint és 6,2 g diciklohexükarbodiimidet, 0°-on addig keverjük, míg az elegy sűrű lesz, majd egy éjszakán át 0°-on állni hagyjuk. Nagy vákuumban kb. 50 ml-re pároljuk be, és a terméket 25 300 ml éterrel kicsapjuk. Az izolált anyagot 0,05 mólos citromsavoldattal és vízzel mossuk és nagy vákuumban 40°-on szárítjuk. Kb. 1 liter izopropanolból átkristályosítva tisztítjuk. így 18,2 g védett oktapeptidszármazékot kapunk. Rf89 = 0,27, szili-30 kagéles vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatban. 33. Z-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OH 10,9 g, 32. pontban leírt oktapeptidmetilésztert 35 70°-on történő melegítés közben 190 ml 90%-os metanolban oldunk. Szobahőmérsékletre hűtés után 30 ml 1 n nátriumhidroxidoldatot, majd 10 perc múlva 160 ml vizet csepegtetünk hozzá. Ezután megszűrjük és a szűrletből a terméket 600 ml 0,04 n 40 jéghideg sósavoldatra öntve kicsapjuk. A szilikagéles vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat során egységesnek bizonyult termék (Rf10 o = 0,45) metanolvíz elegyből átkristályosítható. 45 34. H-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OH-acetát 3,6 g, 33. pontban előállított Z-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OH vegyületet 100 ml 80%-os ecetsavoldatban oldunk és az oldatot 50 0,5 g 10%-os palládium-szén-katalizátor jelenlétében hidrogénezzük. A hidrogénfelvétel megszűnte után a katalizátort leszívatjuk és az oldatot szárazra pároljuk. A színtelen gyantaként keletkezett oktapeptidszármazék acetátját nagy vákuumban szá-55 rítjuk. Szilikagéles vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatban Rf100 = 0,21. 35. Z-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OH 60 11,25 g Z-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-NH-NH2 65 ml dimetilformamidos oldatához —20 és —25° közötti hőmérsékleten 2 perc alatt 8,4 ml 4,2 n dioxános sósavoldatot adunk. Ezután —15 és —20° közötti 65 hőmérsékleten 2,1 ml terc-butilnitritet csepegtetünk 32 .
