167121. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nagytisztaságú gentamicin c komplex és/vagy gentamicin c komponensek előállítására
5 167121 6 (200 000-250 000 gamma/ml) tartalmazza a gentamicin C-t. Ez az oldat csekély mennyiségű szervetlen sókon és színes pigmenteken kívül a gentamicinC mellett már csupán a hozzá hasonló bázisos anyagcseretermékeket tartalmazza. Az eluátum pH-ját, amennyiben szükséges, koncentrált ammóniumhidroxiddal vagy más ammóniumbázissal, például trietüaminnal 8,0-9,0-es pH értékre állítjuk be, majd a kapott oldatot aktívszenes derítés után ammóniumformában levő karboxil-típusú kationcserélő gyantán, célszerűen Amberlíte CG-50 Il-on megkötjük. A gyantaágyat vízzel mosva a maradék szervetlen sókat és pigmenteket eltávolítjuk, és ezután a gyantaágyat 0,1-0,5 n-ig növekvő koncentrációjú ammóniumhidroxid-oldatokkal oldjuk le, 10-100ml/cm2 /óra célszerűen 20-50ml/cm 2 / /óra sebességgel. Aleoldásnál a 0,1-0,18 n ammóniumhidroxi-koncentráció tartományban a gentamicin C-t szennyező kísérő anyagcseretermékek oldódnak le, majd a 0,18-0,25 n ammóniumhidroxid-koncentráció tartományban először a tiszta gentamicin C2 , ezután a gentamicin C 2 és Ci elegye, majd a gentamicin Ct és Ci a elegye, végül a gentamicin Cia oldódik le. Ily módon tehát a gentamicin C komplex mellett a tiszta C2 és Ci a komponensek előállítására is mód nyílik. A gentamicin Ct előállítása kitűnően megoldható a gentamicin C komplexből, vagy bármely más, gentamicin Ci-et tartalmazó vizes oldatból kiindulva ioncserélő dextrángélen végzett kromatográfia segítségével. Ha vízben oldott gentamicin C-t ammónium-formában levő CM-Sephadex C—25 oszlopon megkötünk, majd az oszlopot 0,1—0,3 n-ig fokozatosan növekvő koncentrációjú ammóniumhidroxiddal eluáljuk, az oszlopról legelőször a gentamicin Cia ésC2 komponensek oldódnak le, a C! komponens pedig jól elkülönülve a 0,2-0,3 n ammóniumhidroxidos oldatokkal oldódik le. A gentamicin Ci-et tartalmazó frakciókból a későbbiekben leírt módon állítjuk elő a gentamicin Ci bázist vagy valamilyen sóját. Az így kapott gentamicin C szulfát minősége lényegesen felülmúlja az USP-XVIII követelményeit. Termékünket az USP-XVIII követelményeinek egyébként megfelelő, kereskedelmi forgalomban levő készítményeknél lényegesen (mintegy 10-12%-kal) hatékonyabbnak találtuk. Papír-és rétegkromatográfiás vizsgálatokkal a forgalomban levő készítményekben több, körülbelül 6-8 idegen szennyező anyag jelenléte is kimutatható, míg ezek a szennyező anyagok az eljárásunkkal kapott termékben egyáltalán nem mutatható ki. Kvantitatív vizsgálataink szerint a kereskedelmi forgalomban levő különféle gentamicin készítmények 8-15súly%-ban tartalmaznak a gentamicin C komponensektől eltérő szennyező anyagokat, melyeknek mennyisége az eljárásunkkal kapott gentamicin C-ben 1 súly%-nál kevesebb. A találmány szerinti eljárással kapott gentamicin C szulfát egyéb jellemzőit tekintve is felülmúlja az USP-XVIII követelményeit. Biológiai hatékonysága eléri a 100%-os tisztaságú gentamicin C szulfát 640 gamma/mg hatékonyságát. Fajlagos optikai forgatóképessége a megadott +107—l-121°-os értékhatár felső értékét közelíti meg. Toxicitása azonos az irodalmi adatokkal, nem pirogén, nedvességtartalma 3% alatt van. A komponensek aránya megfelel az USP-XVIII követelményeinek. A gentamicin C és az egyes gentami-5 cin C komponensek infravörös és mágneses magrezonancia spektruma megegyezik az irodalmi adatokkal [J. Infect. Dis. 119, 342 (1969)]. A termékek szulfáthamut nem tartalmaznak, 6%-os vizes oldataik színe pedig a Magyar Gyógyszerkönyv 10 hivatalos színmérték-skálája szerint Zo-nak felel meg. Eljárásunk igen nagy előnye, hogy a nagytisztaságú gentamicin C előállításához szükséges műveletek" igen egyszerűek, anyagigényük minimális, és az 15 eljárás teljes hozama (70—80%) igen jó. Az eljárás nagyüzemileg kiválóan alkalmazható és folyamatossá tehető. Az első lépésben a leoldásnál alkalmazott igen nagy savtöménység lehetővé teszi, hogy a fermentlé gentamicin C tartalmát igen kis 20 térfogatban és relatíve igen nagy koncentrációban, mintegy 20—25%-os vizes oldat formájában kapjuk meg. A nagy savtöménység következtében ez az oldat szervetlen sókat gyakorlatilag alig tartalmaz, és így a felesleges savmennyiségnek valamilyen 25 ammóniumbázissal (például trietilamin vagy ammóniumhidroxid) történő közömbösítése után, közvetlenül a végső tisztítást szolgáló ioncserélő oszlopra vihető. Elkerülhető a nagytérfogatú szerves oldószerek használata, a többszöri szárazra párlás, 30 szűrés stb. Nincs szilárd közbülső termék, hanem a fermentléből a végtermékig az eljárás folyamatosan vihető véghez, a végső tisztítási lépés pedig gyakorlatilag kvantitatív hozammal igen nagy tisztaságú termékeket eredményez, és egyúttal lehetővé teszi 35 az egyes gentamicin C komponensek (elsősorban a C2 ) tiszta állapotban történő előállítását is. Eljárásunk további előnye, hogy a gentamicin C igen jelentős (5-10-szeres) mennyiségű szervetlen só (nátrium-, ammóniumklorid vagy -szulfát) mellől 40 is tiszta, hamumentes termékként nyerhető ki. A találmány szerinti eljárás tehát lehetővé teszi a gentamicin C-nek a szennyezésektől történő tökéletes elválasztásán túlmenően az egyes gentamicin C komponensek elválasztását és a genta-45 micinC komplex összetételének (komponens arányának) befolyásolását is. A leoldás befejezése után vagy az összes gentamicin C-t tartalmazó frakciókból, vagy tetszés szerint az egyes tiszta komponenseket tartalmazó 50 frakciókból a vizet, illetve az ammóniumbázist vákuumban történő elpárologtatással, vákuum bepárlással, porlasztva szárítással vagy liofilizálással eltávolítjuk, és így szabad bázis formájában kapjuk meg a tiszta gentamicin C-t és/vagy az egyes 55 gentamicin C komponenseket. Az így kapott szabad bázis formájú hatóanyagokat ezután ismert módszerekkel, például számított mennyiségű vizes ásványi savban oldva a megfelelő sóvá, például szulfáttá alakítjuk át, és a 60 kapott oldatokból liofilizálással vagy valamely vízzel elegyedő szerves oldószerrel, például metanollal, acetonnal vagy etanollal csapjuk le a megfelelő gentamicin-sót. Dy módon a kereskedelmi forgalomban levő termékeknél lényegesen nagyobb tisz-55 taságú terméket kapunk. A Garamicinnel azonos 3
