166890. lajstromszámú szabadalom • Eljárás FC-126 pulykaherpesvírus és Marek-betegséget okozó JM GA vírus stabil szuszpenziójának és liofilizátumának előállítására

11 166890 3. táblázat 12 A szuszpendálószer komponenseinek hatása a megfertőzött sejttenyészetekből kivont, sejtmentes, FC 126 pulyka-herpesvírus (HVT) törzs koncentrációjára Szuszpendálószer FFU/ kivonáshoz felhasznált hígítószer, ml 9. kísérlet fagy. liofl. 10. kísérlet fagy. liofl. Foszfátpuffer önmagában Foszfátpuffer + a következő komponensek: 10 0 0 0 0,218 M szacharóz 10 0 nem igen 0,0049 M glutamát 10 0 nem igen szacharóz és glutamát 10 0 nem igen 1% szarvasmarha-albumin 3500 25 nem igen szarvasmarha-albumin és szacharóz 3950 1200 nem igen szarvasmarha-albumin és glutamát 1925 75 nem igen szarvasmarha-albumin, szacharóz és glutamát (SPGA) 5650 560 2400 1520 8% zsírtalan lefölözött tejpor és 2% NZ amin 2760 . 85 nem igen 8% zsírtalan lefölözött tejpor nem igen 840 110 Egyéb szuszpendálószerek hígítatlan szarvasmarha magzatszérum (BFS) 100 0 nem igen 15% BFS M199 közegben 50 0 nem igen 10% dimetilszulfoxid és triptóz-foszfát M199 közegben 35 0 nem igen A rövidítések jelentése: FFU = foltképző egység; fagy. = fagyasztott; liofl* = liofilizált. A 3. táblázatban felsorolt adatok olyan kísérletekre vonatkoznak, amelyekben a donor-sejteket (vírusforrást) teljes sejtszuszpenzió formájában, dimetilszulfoxid védőanyag jelenlétében előzetesen fagyasztottuk, majd felengedni hagytuk, pufferoldattal mostuk, végül 1:30 arányban (9. kísérlet) vagy 1:40 arányban (10. kísérlet) hígítottuk a megfelelő folyadékkal, és ultrahanggal kezeltük. Az eredmények azt igazolják, hogy a Marek-féle megbetegedést okozó JM és GA vírusokat vagy az FC—126 pulyka-herpesvírust nagy hozammal kaphatjuk, ha a kivonást, ill. a hígítást a vírust stabilizáló anyag jelenlétében végezzük. Azt tapasztaltuk továbbá, hogy a liofilizálás a vírus koncentráció észrevehető csökkenése nélkül végrehajtható. Az előző táblázatok adataiból azt is megállapíthatjuk, hogy a találmány szerint előállított stabil sejtmentes vírusszuszpenzió koncentrációja Marek-féle megbetegedést okozó JM és GA vírusok esetén 103 vagy annál nagyobb érték, míg az FC—126 pulyka-herpesvírus esetén 105 vagy annál nagyobb érték. Az eredmények azt is igazolják, hogy szarvasmarha magzatszérum jelenlétében, sejttenyészet-közeg felhasználásával vagy anélkül végzett kivonás során a vírust rendkívül alacsony koncentrációval kapjuk, és a vírus a vakcínakénti felhasználáshoz szükséges hatásosságot csaknem teljes egészében elveszti. Az eredményekből látható, hogy a találmány szerinti eljárás nem várt módon igen hatásos módszert biztosít sejthez kötött vírusok kivonására megfertőzött sejtekből, fehérjék (pl. albumin vagy kazein, valamint albumint vagy kazeint tartalmazó anyagok) jelenlétében, amelyek mindegyike adalékanyag gal, pl. szacharózzal és hasonlókkal együtt is felhasználható. A példák szerint a vírusok intakt és életképes formában történő felszabadítása érdekében a sejtbontást ultrahangbesugárzással végezzük. Szakember számára nyilvánvaló, hogy a sejtbontást egyéb 35 módszerekkel (pl. fagyasztással-felengedéssel, alacsony hőmérsékleten végzett homogenizálással stb.) is végrehajthatjuk. A találmány szerinti kivonási művelet egyetlen döntő jellemzője az, hogy a sejtek szétbontását a vírust stabilizáló anyag jelenlétében 40 kell végezni, ugyanis csak így kaphatunk életképes sejtmentes vírusokat. 2. példa FC—126 pulyka-herpesvírussal megfertőzött sej-45 tekét stabilizálószerkónt különböző mennyiségű szarvasmarha-albumínt tartalmazó oldatok jelenlétében ultra hangbesugárzással elroncsolunk. A kapott sejtmentes készítmények hatékonyságát (fertőzőképességi koncentrációját) a következőképpen 50 határozzuk meg: Csirke-embrió kötőszövet (CEF) sejtek primer tenyészetét FC—126 pulyka-herpesvírus törzzsel oltjuk be. 3 napos inkubálás után a 210 Petri-csészébe (átmérő: 60 mm) töltött megfertőzött sejteket 55 ismert tripszines kezeléssel összegyűjtjük; összesen 1,4 XlO9

sejtet kapunk. A sejtek tenyésztését és a megfertőzött sejtek tripszines kezelését a „Diagnostic Procedures for Viral and Rickettsial Infections" című könyv (4. kiadás, American Public Health 60 Association, Inc. New York, 1969) 96—100. oldalán ismertetett módszerrel vágeztük. A tömörített sejtek térfogata 1200fordulat/perc sebességen lOpercigvégzett centrifugálás után kb. 3 ml. A tömörített sejteket 60 ml sejttenyészet-közegben (199. sz. közeg +10% 65 triptóz-foszfát táptalaj) újra szuszpendáljuk. 6X10 6